Quali test possono aiutarmi a diagnosticare un’anemia emolitica immuno-mediata (IMHA) e quali campioni devo prelevare?

Quando sospettare l’emolisi?

Sospettiamo l’emolisi soprattutto nell’anemia rigenerativa, quando è stata esclusa la perdita di sangue (fig. 1).

Nella maggior parte dei casi, l’anemia emolitica è grave e mostra segni di rigenerazione più forti rispetto all’anemia da perdita di sangue. In caso di emolisi, gli eritrociti vengono distrutti. Oltre all’IMHA primaria (indicata come IMHA non associativa), molte altre patologie sottostanti possono causare emolisi (fig. 2).

Quali test devono essere eseguiti?

Il materiale richiesto per la diagnosi di IMHA è elencato nella fig. 3.

Emocromo/citomorfologia (striscio di sangue): fornisce informazioni sulla rigenerazione ed è utile come prima panoramica, ad es. per rilevare agenti infettivi.
La morfologia degli eritrociti può anche fornire informazioni importanti sulla causa dell’anemia. In Laboklin, la conta reticolocitaria è inclusa in ogni emocromo di cane e gatto. L’emocromo deve essere misurato su sangue in EDTA il prima possibile dopo il prelievo, poiché la fragilità eritrocitaria dei cani con IMHA è aumentata.

Chimica del sangue: la misurazione della bilirubina sierica e delle proteine totali per identificare la causa dell’anemia può aiutare a differenziare emolisi ed emorragie.

Analisi delle urine: in alcuni casi di emolisi possono essere presenti bilirubinuria o emoglobinuria. Da notare che nei cani, specialmente nei cani maschi, un risultato del test debolmente positivo può essere fisiologico.

Agenti infettivi: per rilevare agenti infettivi come la babesia e il micoplasma emotropo nelle fasi acute, si raccomanda l’analisi molecolare (PCR). Inoltre, dovrebbero venire esclusi agenti patogeni come ehrlichia e anaplasma.
Per l’ehrlichia, può essere utile un’ulteriore determinazione del titolo anticorpale.

Test per diagnosticare la distruzione immunomediata

Sferociti: la presenza dei cosiddetti sferociti (fig. 4) nello striscio di sangue può fornire preziose informazioni su una distruzione immunomediata degli eritrociti. Il materiale da campionare richiesto per il loro rilevamento è di due – tre strisci di sangue preparati direttamente dopo il prelievo.

Autoagglutinazione: osservando il campione in EDTA, si può notare la presenza di un’autoagglutinazione non specifica. Questo risultato dovrebbe essere seguito da un test di agglutinazione salina e da un test di Coombs.

Test di Coombs: adatto a rilevare la presenza di autoanticorpi sulla superficie degli eritrociti. Materiale da prelevare: sangue fresco in EDTA. Se il campione viene conservato refrigerato, il test può essere valutato fino a 5 giorni dal prelievo.

Domande frequenti sulla valutazione del test di Coombs

Qual è il principio del test di Coombs?

Il test di Coombs, chiamato anche DAT (Direct Antiglobulin Test), verifica la presenza di anticorpi sulla superficie dei globuli rossi (fig. 5).

Sul mercato sono disponibili diversi metodi di test: gel test, strip test, test di citometria a flusso, il noto test su micropiastra e altro ancora.

Tutti i test menzionati sono adeguati per la diagnosi di IMHA nell’uomo e nel cane. Alcuni test sono disponibili in commercio anche per gatti e cavalli.

Qual è il principio del metodo della micropiastra?

In medicina veterinaria, la micropiastra è il metodo più utilizzato. L’antiglobulina (reagente di Coombs) viene gradualmente diluita (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, ecc.), quindi vengono aggiunti eritrociti lavati e incubati per almeno 30 minuti.

Se non si verifica alcuna reazione, le cellule del sangue sedimenteranno sul fondo dei pozzetti e dopo l’incubazione si osserverà solo un minuscolo punto rosso: il test sarà negativo.
Se il test è positivo, le antiglobuline aggiunte legano gli eritrociti impedendo loro di cadere sul fondo del pozzetto. Gli eritrociti ricoprono completamente o quasi il pozzo.
Se solo i primi due pozzetti (1:2 e 1:4) mostrano positività, il test è ancora considerato negativo, perché questi titoli bassi sono considerati aspecifici. I titoli da 1:8 in su sono considerati positivi. Non è raro vedere titoli superiori a 1:1024 in caso di IMHA.

Che cos’è un effetto prozona?

L’effetto prozona è un fenomeno osservato in campioni altamente positivi. L’alta concentrazione di anticorpi anti- eritrociti inibisce la reazione positiva. Un esempio è illustrato di seguito (fig. 6).

Il campione di sangue EDTA presenta un coagulo di sangue, il test di Coombs è in grado di superarlo?

Sfortunatamente no. La presenza di globuli rossi intatti è indispensabile per l’esecuzione di un corretto test di Coombs. Tuttavia, è importante conoscere la differenza tra un coagulo di sangue e un’agglutinazione. Il coagulo di sangue è il risultato della coagulazione fisiologica, e può verificarsi quando il campione non è miscelato correttamente con l’anticoagulante EDTA. Il coagulo di sangue è irreversibile. Per evitare ciò: dopo il campionamento, capovolgere delicatamente e ripetutamente il campione. L’agglutinazione può essere causato da diversi fattori. Nella maggior parte dei casi, l’agglutinazione è reversibile, ad es. riscaldando il campione in mano o lavando le cellule.