{"id":1521937,"date":"2017-04-06T10:45:06","date_gmt":"2017-04-06T08:45:06","guid":{"rendered":"https:\/\/laboklin.com\/?p=1521937"},"modified":"2024-10-17T11:07:19","modified_gmt":"2024-10-17T09:07:19","slug":"la-diagnostica-sierologica-nella-clinica-equina-valutazione-dei-titoli-anticorpali","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/laboklin.com\/it\/la-diagnostica-sierologica-nella-clinica-equina-valutazione-dei-titoli-anticorpali\/","title":{"rendered":"La diagnostica sierologica nella clinica equina: valutazione dei titoli anticorpali"},"content":{"rendered":"

[vc_row][vc_column][vc_column_text css=””]Per la diagnostica delle malattie infettive e parassitarie possiamo avvalerci di molteplici metodiche che utilizzano siero, plasma od altri materiali, differenti di volta in volta a seconda delle caratteristiche peculiari della malattia che costituisce il sospetto diagnostico. Un\u2018importante differenziazione \u00e8 quella tra la ricerca del titolo anticorpale \/ antigenico dopo contatto del sistema immunitario con l\u2018agente infettivo (anticorpo, Ac – antigene, Ag) e la ricerca ed amplificazione genica dell\u2018agente eziologico dopo prelievo del materiale idoneo tramite PCR (Polimerase chain reaction).<\/p>\n

Titolazione anticorpale (Ac)<\/h2>\n

Si effettua generalmente su siero o plasma. Permette di valutare la presenza di anticorpi (quindi una sieropositivit\u00e0) dopo che il sistema immunitario del paziente, non immunodepresso, ha preso contatto con l\u2018agente eziologico oggetto di ricerca. Questo comporta la scelta del momento migliore per il prelievo ed uno sforzo supplementare per l\u2018interpretazione dei risultati: una sieropositivit\u00e0 infatti non indica necessariamente malattia, viceversa definisce un contatto diretto attuale o pregresso o ancora pu\u00f2 indicare una vaccinazione avvenuta (gli anticorpi vaccinali sono raramente differenziabili). A questo proposito \u00e8 molto importante chiarire il concetto di siero-conversione<\/strong>, che \u00e8 un criterio di interpretazione basilare: effettuo un primo prelievo entro il 5\u00b0 giorno dall\u2018inizio della sintomatologia e successivamente effettuo un secondo prelievo dopo 15-45 giorni dal primo. Confronto i titoli Ac rilevati: ho una positivit\u00e0 <\/strong>se nel secondo esito l\u2019aumento del titolo anticorpale \u00e8 di almeno 4 diluizioni in base 2 (1:8 \/ 1:16 \/ 1: 32…) oppure, col solo siero\/plasma prelevato dopo 15-45 giorni, se il titolo supera la soglia convenzionale fissata per quella data malattia che empiricamente indica un contatto con il patogeno \/ una profilassi vaccinale. Per alcune malattie gravi del cavallo la semplice positivit\u00e0 \u00e8 sufficiente a confermare la diagnosi anche in assenza di sintomatologia, attivando quindi le procedure di Polizia Veterinaria previste, con l\u2019isolamento del soggetto: \u00e8 il caso dell\u2018Anemia infettiva equina <\/em>e della Morva<\/em>, mentre per l\u2018Arterite virale ed <\/em>il Morbo coitale maligno <\/em>oltre alla positivit\u00e0 viene valutata anche la presenza \/ eliminazione dell\u2018agente eziologico con lo sperma o tramite le vie genitali prima di escludere il soggetto dall\u2018attivit\u00e0 riproduttiva.<\/p>\n

Metodiche di titolazione Ac<\/h2>\n

ELISA indiretta<\/strong>: si tratta della metodica pi\u00f9 recente, standardizzata e veloce, utilizzabile per una titolazione anticorpale. Gli anticorpi del siero\/plasma in esame (se presenti) si fissano su una fase solida con l\u2018antigene (pozzetto), si aggiunge il marcatore con un enzima (perossidasi) e un substrato cromogeno. Se il cromogeno incontra la perossidasi del marcatore che si \u00e8 fissato alla fase solida in presenza degli anticorpi, abbiamo una reazione colorimetrica del pozzetto, altrimenti in assenza di anticorpi la reazione non avviene ed il campione non mostra alcun colore. Il pozzetto con la diluizione maggiore che mostra viraggio permette di quantificare la presenza degli Ac (maggiore \u00e8 la diluizione che si colora, maggiore \u00e8 la quantit\u00e0 di anticorpi presente).<\/p>\n

Nella Competitive ELISA <\/strong>invece abbiamo un ulteriore passaggio: la colorazione viene valutata non direttamente ma tramite aggiunta di un secondo marcatore colorato che si fissa sul substrato in assenza di coniugazione con il primo marcatore: in questo caso si avr\u00e0 colorazione in caso di assenza di anticorpi nel campione in esame ed il risultato espresso in % di colorazione va letto in senso inverso (maggiore \u00e8 la colorazione, minore \u00e8 il titolo anticorpale perch\u00e9 minore \u00e8 la coniugazione con il primo marcatore). I valori ottici della colorazione espressa dalla reazione ELISA non sono correlabili con il titolo bens\u00ec con le caratteristiche del cromogeno, quindi l\u2018interpretazione dei risultati non \u00e8 operatore-dipendente.<\/p>\n

Immunofluorescenza indiretta: <\/strong>la metodica indiretta prevede che gli anticorpi del siero\/plasma da testare, se presenti, reagiscano legandosi ad un substrato di antigeni, utilizzando poi un secondo anticorpo coniugato con la sostanza fluorescente che si leghi al primo complesso Ag-Ac, quando presente, determinando vari gradi di fluorescenza, valutabile come intensit\u00e0 da un operatore. Si tratta di una metodica di notevole amplificazione, molto sensibile, ma la fluorescenza deve essere interpretata e possono esserci casi dubbi sui valori soglia.<\/p>\n

Agglutinazione passiva diretta: <\/strong>il principio utilizzato \u00e8 la precipitazione dei globuli rossi (Gr) che si verifica se nel siero\/plasma preso in esame vi \u00e8 la presenza di anticorpi ad effetto agglutinante, utilizzando delle diluizioni seriali di materiale da esaminare e mettendole in contatto con dei Gr coniugati ad una quantit\u00e0 fissa di antigene. Risulta possibile valutare la sieropositivit\u00e0 del campione espressa dalla formazione di un reticolo di eritrociti con precipitazione sul fondo del pozzetto e surnatante limpido. Viceversa, se il complesso Ag-Gr rimane in sospensione, senza che sia avvenuta quindi una agglutinazione, consideriamo il campione negativo. Molto sensibile e specifico, necessita di incubazione a temperatura controllata.<\/p>\n

Inibizione dell\u2018emoagglutinazione: <\/strong>viene utilizzata quando gli agenti eziologici sono emoagglutinanti, sia virus che batteri, mentre gli anticorpi ricercati non lo sono. Mettendo in contatto le varie diluizioni di siero\/plasma da testare con una quota fissa di antigene ed una quota di globuli rossi, se non si verificano degli immunocomplessi Ag-Ac si avr\u00e0 emoagglutinazione con precipitazione verso il fondo del pozzetto delle emazie e quindi il campione testato risulter\u00e0 negativo. Viceversa, una soluzione in cui gli eritrociti rimangono in sospensione indica che nel materiale da testare sono presenti anticorpi che inibiscono la precipitazione e quindi considero il campione positivo con una titolazione corrispondente alla prima diluizione che non presenta agglutinazione.<\/p>\n

Fissazione del complemento: <\/strong>permette di evidenziare una categoria di anticorpi che non danno alcuna azione visibile interagendo con l\u2018antigene ma fissano il complemento che \u00e8 composto da una serie di proteine presenti nella parte liquida del sangue che interagiscono con le membrane cellulari attivandone la lisi, coadiuvando e completando appunto l\u2018azione del sistema immunitario. Si mette in contatto il siero\/plasma da testare con l\u2018Ag e si incuba a 56\u00b0 C per 30 minuti per attivare il complemento. Se si verifica la reazione Ag+Ac, questo \u201efissa\u201c il complemento che quindi non \u00e8 pi\u00f9 disponibile per altre reazioni (in questo caso per la lisi delle emazie se si immettono successivamente degli eritrociti con Ac anti emazie abbinati) e possiamo considerare il nostro campione positivo. Se invece il materiale da testare \u00e8 privo di anticorpi, il complemento rimarr\u00e0 libero ed avremo l\u2018emolisi nella seconda reazione che qualifica il nostro campione come negativo.<\/p>\n

Sieroneutralizzazione: <\/strong>si utilizza per la diagnostica sierologica da virus citopatogeno, che provoca cio\u00e8 dei danni visibili su tessuto-coltura. Il virus incubato nella tessuto-coltura, posto a contatto con l\u2018emosiero di un soggetto con anticorpi, perde il suo potere infettante perch\u00e9 gli Ac specifici ricoprono i virioni ed ne impediscono l\u2018adsorbimento in condizioni di temperatura e tempistica adatti. Se il virus \u00e8 rimasto libero, posso vedere sul tessuto un effetto citopatico con interruzione del monostrato cellulare, viceversa ci\u00f2 non avviene. Il titolo sieroneutralizzante risulta essere la diluizione massima che neutralizza il virus. L\u2018allestimento delle linee cellulari e delle diluizioni virali standardizzate non risulta molto pratico, quindi quando possibile si preferiscono metodiche pi\u00f9 recenti ed immediate come ELISA e IF.<\/p>\n

Immunodiffusione in gel di Agar (AGID test): <\/strong>si tratta di una metodica di precipitazione radiale, semi-quantitativa, ad interpretazione, che richiede tempistica di almeno 24 ore. Si utilizza una piastra di Petri con un pozzetto centrale contenente l\u2018Ag, circondato da 3 pozzetti con reagente con Ac e 3 pozzetti dove posizionare il siero da testare. Se il siero \u00e8 negativo, avremo delle linee di precipitazione Ag-Ac sul gel di Agar solamente tra il pozzetto centrale con l\u2018Ag ed i 3 conosciuti positivi (gli altri 3 pozzetti non avranno alcuna linea), altrimenti avremo altre linee di precipitazione, una per ogni campione positivo dei 3 da esaminare. \u00c8 la metodica ufficiale per la conferma di positivit\u00e0 per l\u2018Anemia infettiva, purtroppo la tempistica \u00e8 di almeno 24 ore e l\u2018allestimento delle piastre \u00e8 piuttosto laborioso ma a differenza della metodica ELISA non sono possibili reazioni crociate.[\/vc_column_text][\/vc_column][\/vc_row][vc_row type=”vc_default” gap=”10″ equal_height=”yes” content_placement=”middle” css=”.vc_custom_1700654288426{margin-top: 30px !important;}”][vc_column width=”1\/6″ css=”.vc_custom_1725612885274{background-color: #e7e7e7 !important;}”][vc_icon icon_fontawesome=”fas fa-file-pdf” color=”custom” size=”xl” align=”center” css=”.vc_custom_1729155270605{margin-top: 10px !important;margin-bottom: 10px !important;padding-top: 20px !important;padding-bottom: 20px !important;}” custom_color=”#e51e1e” link=”url:https%3A%2F%2Flaboklin.com%2Fwp-content%2Fuploads%2F2024%2F10%2FLa-diagnostica-sierologica-nella-clinica-equina-valutazione-dei-titoli-anticorpali.pdf|target:_blank”][\/vc_column][vc_column width=”5\/6″ css=”.vc_custom_1725612900714{background-color: #e7e7e7 !important;}”][vc_column_text css=”.vc_custom_1729155305593{margin-top: 10px !important;margin-bottom: 10px !important;padding-top: 20px !important;padding-bottom: 20px !important;}”]La diagnostica sierologica nella clinica equina: valutazione dei titoli anticorpali<\/strong><\/a>[\/vc_column_text][\/vc_column][\/vc_row]<\/p>\n<\/div>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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