L’esame delle urine nella specie equina deve sempre costituire parte integrante della valutazione della funzionalità dell’emuntorio in tutti quei casi in cui si rilevino grosse anormalità della produzione e delle caratteristiche chimico-fisiche dell’ urina stessa, nella frequenza e nelle caratteristiche della minzione ed importanti squilibri nell’assunzione di acqua.

Nel cavallo la raccolta di urine può avvenire per minzione spontanea o per cateterismo, quest’ultimo preferibile in ogni caso ed obbligatorio per un esame batteriologico. Questa manualità permette inoltre di valutare la pervietà dell’uretra. Nel puledro neonato è possibile inoltre raccogliere il materiale tramite cistocentesi.

Vediamo in dettaglio come effettuare queste manualità.

Cateterismo nel maschio

Si effettuano:

• una leggera sedazione per favorire il rilassamento del pene
• un lavaggio del prepuzio con una soluzione disinfettante
• utilizzando guanti e gel sterili si estroflette l’uretra e si inserisce il catetere con la destra, tenendo il corpo del pene con la sinistra
• attenzione all’eventuale presenza di calcoli che possono bloccare il catetere (in questi casi meglio non forzare ed utilizzare piuttosto un endoscopio)
• se la vescica è piena una volta che il catetere entra nell’organo l’urina defluisce prontamente
• se la vescica è semivuota può essere necessario aspirare il liquido tramite una siringa da 60 ml oppure recuperare l’urina rimasta nel catetere una volta sfilato

Cateterismo nella femmina

Si procede come segue:

• di solito non è necessaria alcuna sedazione
• si prepara asetticamente il perineo e la vagina come per un’inseminazione
• si utilizzano guanti e gel sterili
• si introduce la mano (guantata con guanti e gel sterile) con il catetere in vagina palpando il pavimento fino ad incontrare l’ostio uretrare a circa 10 cm dalle labbra vulvari
• si guida il catetere con un dito nell’ostio spingendolo verso il basso
• la vescica si raggiunge rapidamente dopo aver introdotto circa 10 cm di catetere
• se non inizia il flusso di urina è possibile anche in questo caso utilizzare una siringa per aspirare il contenuto.

Cistocentesi nel puledro neonato

Si prepara l’addome caudale come per una normale centesi addominale radendo il pelo e disinfettando la cute e si procede come segue:

• si posiziona il puledro leggermente sedato in decubito laterale
• si infiltra il sottocute con una piccola quantità di lidocaina
• si procede ad effettuare la centesi con un trocar od un’agocannula, aspirando il contenuto con una siringa
• si toglie l’agocannula / trocar e si applica una medicazione locale.

Analisi dell’urina

Aspetto

L’urina normale di equino appare di un colore giallo carico e generalmente piuttosto torbida, per la presenza di carbonato di calcio e piccole quantità di muco.

Sedimento

Si centrifugano le urine a 800 rpm per 10 minuti, si elimina il surnatante e si striscia il pellet ottenuto su un vetrino che viene poi colorato in laboratorio. Con l’esame microscopico si rileva la presenza di cellule di sfaldamento normali o patologiche, leucociti ed eritrociti (che aumentano in caso di infiammazione, emorragia o neoplasie), cilindri (che se presenti in elevata quantità possono indicare danno dell’epitelio renale), batteri (che indicano sempre infezione) e cristalli di carbonato / fosfato / ossalato di calcio che nel cavallo rappresentano la normalità.

pH (range 7 – 8,4)

Di solito è leggermente alcalino per effetto della dieta vegetale, tendente al neutro o leggermente acido nei soggetti che vengono alimentati con elevate quantità di cereali. La presenza di batteri, un eccessivo allenamento o disturbi metabolici gravi possono portare alla produzione di urine molto acide.

Peso specifico (1025 – 1060)

In base a questo parametro possiamo valutare la funzione renale in relazione al bilancio idrico del soggetto, infatti le urine possono essere definite:

• isostenuriche (1008 – 1014): con la medesima concentrazione del siero, quindi filtrate senza alcuna attività tubulare specifica
• ipostenuriche (< 1008): più diluite del siero, indicando una mancata capacità renale di concentrazione, che potrebbe essere dovuta alla mancanza di vasopressina, ad un danno renale precoce o ad un eccesso di assunzione di acqua (per una fluidoterapia aggressiva o per disordini endocrini o neurologici)
• iperstenuriche (> 1060): un’urina più concentrata del siero potrebbe indicare disidratazione, ma anche un’alterazione grave del processo di filtrazione glomerulare con anomalie del riassorbimento tubulare. Questa condizione può essere abbinata ad azotemia pre-renale (per limitata perfusione d’organo) od associata a glicosuria / proteinuria.

Proteine

Nelle urine di cavallo sono normalmente presenti piccole quantità di proteine. Una proteinuria elevata indica invece un danno glomerulare o tubulare, un’infiammazione od un’emorragia. Una proteinuria transitoria si verifica in caso di performance sportive elevate, quindi meglio non prelevare le urine post esercizio.

Emo / Mioglobina

La presenza di queste proteine globulari nelle urine indica la presenza di eritrociti (interi o lisati) o che si è verificato un danno muscolare grave che ha prodotto elevati livelli di mioglobina nel siero.

Bilirubina / Urobilinogeno

Sono pigmenti che indicano una grave emolisi sistemica od epatopatia con colestasi.

Glucosio

Se si riscontra nelle urine significa che la glicemia è fuori range (maggiore di 180 mg/dl) per patologie ormonali (EMS, Sindrome di Cushing), grave stress o setticemia nei puledri e si associa ad urina ipostenurica. In alternativa, se è presente con glicemia nella norma, indica grave disfunzione tubulare.

Chetoni

Sono presenti in caso di massivo catabolismo proteico, per cachessia o neoplasie.

Nitriti

Sono prodotti da alcuni batteri, quindi sono un indice precoce di infezione delle vie urinarie.

Test funzionali

Rapporto proteina / creatinina urinaria

Esaminare il rapporto tra la frazione proteica delle urine e la creatinina (che viene normalmente escreta senza alcuna modifica da parte del rene, seguendo il gradiente ematico), permette di quantificare l’entità della perdita della proteine per via urinaria.

Un rapporto ottimale infatti deve essere < 1, quindi vuol dire che la creatinina escreta deve essere sempre maggiore rispetto alle proteine presenti.

Escrezione frazionata degli elettroliti sierici / Creatinina urinaria

I reni regolano la concentrazione ematica di Na e Cl, Ca, Ph e K e la valutazione del rapporto tra l’escrezione urinaria di elettroliti – confrontando i livelli sierici con quelli urinari e rapportandoli ai corrispettivi valori di creatinina sierica ed urinaria – permette di calcolare un valore espresso in percentuali per ogni elettrolita, parametro che stima la presenza di una disfunzione renale localizzandola anatomicamente (tubulo distale o prossimale) o di gravi squilibri nutrizionali.

Il prelievo ematico ed urinario devono essere simultanei. Questo test non deve essere effettuato in animali sedati, trattati con diuretici o sottoposti a fluidoterapia.

GGT urinarie

La presenza di GGT nelle urine indica un danno con perdita delle cellule dell’epitelio tubulare che appunto, lisandosi, liberano questi enzimi, di solito a causa di gravi fenomeni infiammatori, necrotici o neoplastici.

La misurazione viene sempre effettuata rapportandola alla creatinina urinaria.

Batteriologia

I campioni maggiormente adatti per la coltura batterica sono quelli presi tramite catetere. In letteratura si consiglia una coltura di tipo quantitativo poiché le vie urinarie non sono sterili. Purtroppo l’urina è un materiale che va incontro velocemente alla contaminazione batterica anche se tenuto in frigorifero e spedito refrigerato, considerando anche i tempi di trasporto.
Un’opzione valida potrebbe essere quella di effettuare un tampone con medium al momento della raccolta, anche se in questo caso non risulta possibile quantizzare le colonie batteriche.

La presenza di personale di laboratorio esperto permette comunque una corretta interpretazione della patogenicità della crescita batterica per le vie urinarie.

La presenza di nitriti, leucociti od alterazioni del pH nel materiale inviato contribuiscono a diagnosticare un’infezione.

Elettroforesi delle proteine urinarie

E’ possibile l’esecuzione di un’elettroforesi urinaria se la quantità di proteine rilevate nelle urine risulta sufficiente. Questo esame permette di quantificare il tipo di proteine escrete e conseguentemente indirizza il clinico verso la corretta stima della gravità del danno renale presente, che è direttamente proporzionale alla dimensione delle proteine che si riscontrano nell’urina presa in esame.

Vediamo ora a grandi linee quali sono i reperti urinari / sierologici tipici di alcune patologie

Patologia renale acuta

• Urine: isostenuria, glicosuria e proteinuria leggera, rapporto ggt / creatinina urinaria alterato.
• Sedimento: presenza di leucociti, cilindri, ematuria.
• Siero: SDMA, BUN e creatinina elevate, i livelli di Mg / Na / Ph / Cl di solito bassi.

Patologia renale cronica

• Urine: poliuria con iso-ipostenuria, leggera proteinuria.
• Sedimento: possiamo avere batteriuria, leucociti ed eritrociti ma, essendoci poliuria, il sedimento potrebbe anche essere poco indicativo.
• Siero: SDMA, BUN e creatinina sono elevate. Quest’ultima può essere utilizzata come marker prognostico negativo se i livelli non si abbassano in corso di terapia. I livelli di Ph / Cl / Na sono di solito bassi mentre si riscontra ipercalcemia ed iperkaliemia oltre ad un’anemia non rigenerativa per carenza di eritropoietina. Negli stadi finali possiamo avere inoltre iperlipidemia ed acidosi metabolica.

Rottura della vescica (puledri)

• Urine: nessuna anomalia particolare (in caso di rottura parziale si ha produzione ridotta di urina e non completa assenza).
  Si consiglia una centesi addominale se il rapporto tra la creatinina ematica / creatinina peritoneale è > di 2 – possiamo ipotizzare un uroperitoneo.
• Sedimento: se si riscontra la presenza di cristalli nel fluido peritoneale possiamo ipotizzare una rottura della vescica.
• Siero: i livelli di Na / Cl sono bassi mentre i livelli di K elevati. La creatinina è di solito, anche se non sempre, elevata.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

La nomenclatura delle malattie respiratorie degli equini è stata recentemente rivista. La RAO (ostruzione ricorrente delle vie aeree; precedentemente chiamata pneumopatia cronica ostruttiva COPD), la IAD (malattia infiammatoria delle vie aeree) e la SPAOPD (malattia polmonare ostruttiva associata al pascolo estivo), sono ora indicate come “asma equino (sindrome)” (Bond et al., 2018). L’asma equina è una malattia polmonare con chiare caratteristiche di ipersensibilità, simile ad alcune forme di asma umana. È associata all’infiammazione broncoalveolare neutrofilica, al broncospasmo e all’eccessiva secrezione di muco, rappresentando un modello ideale per lo studio dell’asma umana.

IAD: malattia da lieve a moderata nell’ambito della sindrome asmatica equina, reversibile e con prognosi migliore!

RAO: stessa malattia della COPD ma definita in modo meno preciso. Il termine RAO è più diffuso nei paesi di lingua inglese.

Il vecchio termine “COPD” non viene più utilizzato perché deriva dalla medicina umana e ha diverse patogenesi (fumo e gas nocivi).

Si suggerisce di utilizzare asma equina lieve, moderata e grave e di non utilizzare più le altre terminologie.

Nella popolazione equina è stata riportata un’incidenza di asma >14%. I segni clinici sono innescati da una reazione allergica a un’ampia varietà di allergeni, comprese le spore di muffe nella polvere di fieno e paglia, polline, acari della polvere domestica e acari dello stoccaggio presenti nella polvere della stalla e dei mangimi. A seconda della presenza degli allergeni coinvolti, la malattia può manifestarsi stagionalmente o tutto l’anno.

Sono principalmente colpiti i cavalli più anziani in stalla (> 6 anni) per cui, tra l’altro, sono considerati fattori coinvolti nelle allergie il clima della stalla, il tipo di lettiera e di alimentazione. In inverno, l’aria della stalla è particolarmente inquinata da spore fungine e le allergie respiratorie si verificano con particolare frequenza in questo periodo dell’anno. In rari casi, specialmente negli animali al pascolo, l’asma equina si verifica solo stagionalmente. Questo problema è noto come SPAOPD (malattia polmonare ostruttiva associata al pascolo estivo) la cui causa è una allergia ai pollini.

La natura incurabile dell’asma equina porta spesso all’eutanasia o al pensionamento anticipato dei cavalli colpiti. La prevenzione mirata degli allergeni è senza dubbio la migliore terapia per i processi allergici. Uno studio ha visto che la funzione polmonare potrebbe essere migliorata già tre giorni dopo l’istituzione di un sistema di gestione ambientale per gli animali interessati. Tuttavia, in molti casi, un cambiamento di successo nelle condizioni di allevamento degli animali colpiti non è coerentemente fattibile per un’ampia varietà di ragioni. I ricercatori che hanno esaminato la relazione tra RAO e IBH (ipersensibilità al morso di insetto, prurito dolce) hanno concluso che i cavalli con RAO hanno un rischio maggiore di sviluppare IBH.

Diagnosi

Per una corretta diagnosi sono necessari un’anamnesi dettagliata e un esame clinico dell’animale, determinando l’elenco delle diagnosi differenziali, che vengono confermate o escluse con l’ausilio di test diagnostici. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) fornisce un prezioso contributo alla diagnosi delle malattie respiratorie. Una diagnosi definitiva dell’allergia e, soprattutto, l’identificazione degli allergeni coinvolti, è il presupposto per una promettente terapia dall’effetto duraturo.

La reazione allergica agli allergeni ambientali (pollini, acari della polvere domestica, acari dello stoccaggio, muffe, ecc.) è caratterizzata dalla sovrapproduzione di IgE. I test sierologici allergologici valutano i livelli ematici di IgE specifiche contro diversi allergeni. È stata riportata una relazione diretta tra livelli di IgE antiacaro significativamente elevati nei cavalli con RAO rispetto ai cavalli sani.

Prima di prelevare il campione di sangue, devono essere osservati i tempi di sospensione dei farmaci (soprattutto glucocorticoidi, compresi quelli topici e inalatori).

Trattamento

Il trattamento ideale per l’allergia è senza dubbio quello di evitare gli allergeni responsabili, ma di solito questo non è fattibile. I migliori risultati si otterrebbero con un cambio dell’ambiente dell’animale (altre parti del paese, pascoli alpini, mare, stalla aperta rispetto a box, ecc.). Si tratta di un cambiamento significativo nelle condizioni di allevamento degli animali, che richiede tempo e denaro. Nella maggior parte dei casi non può essere garantita l’eliminazione degli allergeni.

Come alternativa e frequentemente, vengono utilizzati farmaci (ad es. glucocorticoidi) per trattare questo quadro clinico. Ciò significa che i segni clinici sono controllati, ma la causa stessa non viene trattata.

Quando ci troviamo di fronte ad una fattrice con gravidanza a rischio oltre che monitorare attentamente la fase di maturazione fetale, appare di fondamentale importanza organizzare un’adeguata assistenza al parto con l’ausilio di telecamere, allarmi e personale preparato.

Non sempre infatti le cavalle mostrano i classici segni di parto imminente, soprattutto se primipare: perdita del tappo mucoso, rilassamento dei legamenti sacroischiatici della coda e dei muscoli glutei, abbassamento dell’addome, ingrossamento della vena e del parenchima mammario, formazione delle “cere” (gocce di colostro coagulato) a livello di capezzoli o addirittura perdita di piccole quantità dello stesso poco prima del parto.

Negli ultimi anni si è sviluppata una metodica piuttosto semplice che può agevolare il personale nel riconoscere l’avvicinarsi del parto, oppure può dare delle indicazioni chiare al veterinario che si trovi a dover indurre il parto medesimo per i più svariati motivi: il controllo della concentrazione di alcuni elettroliti nelle secrezioni mammarie antecedenti la produzione di colostro e latte.

Si utilizzano 1,5–2 ml di secrezioni raccogliendole in un piccolo contenitore, preferibilmente alla sera dopo le 17:00, poi si aggiunge dell’acqua distillata in proporzioni 1:6 e di seguito si mescola con i reagenti o si immerge nella soluzione la striscetta misuratrice, a seconda del tipo di test prescelto.

Secrezioni mammarie

Il monitoraggio di queste secrezioni fornisce un indice attendibile di maturazione fetale. Per innescare le contrazioni uterine risulta indispensabile la presenza di un livello ematico adeguato di Ca, Na e K che si riflette appunto nelle secrezioni ghiandolari mammarie, il tutto ovviamente in condizioni di normalità.

Per il Ca lo schema rilevato è il seguente:

• fino a 200 ppm: parto non imminente, si consiglia di ripetere il test ogni 24 ore
• tra 200 e 350 ppm: il puledro ha raggiunto la maturità e questo è considerato un range sicuro per un’eventuale induzione, si consiglia di applicare l’ allarme parto se disponibile e ripetere il test ogni 12/24 ore
• oltre 350 ppm: parto imminente

Questa misurazione è effettuabile in campo in modo veloce ed economico tramite i kit della durezza dell’acqua (Dupla, Sera, Merckoquant, Foal watch, Aquadur, …) con soluzioni o striscette che virano di colore; il punto chiave infatti è il l’utilizzo regolare 1 o 2 volte al giorno, tutti i giorni senza eccezioni dal momento che si rilevano le prime secrezioni fino a parto avvenuto.

Questo parametro ha però maggiore attendibilità in senso negativo: quasi nessuna fattrice partorisce con livelli di Ca inferiore a 200 ppm. Una volta superata la soglia dei 350 ppm sappiamo che il feto è pronto per il parto ma le tempistiche sono alquanto variabili.

Il parto può avvenire da 1–3 giorni fino a 7–10 giorni dopo il superamento, specialmente nelle fattrici che tendono a perdere latte. Le primipare possono invece partorire con livelli di Ca più bassi.

La presenza di patologie placentari può condizionare negativamente la maturazione dell’attività secretoria. In questi casi la misurazione degli elettroliti non risulta indicativa.

Congiuntamente all’innalzamento dei livelli di calcio, si assiste all’inversione del rapporto tra Na e K: dopo che si verifica questa inversione (con abbassamento repentino del Na <30 mmol/L ed un innalzamento rapido del K >35 mmol/L) il parto avviene solitamente entro 24/48 ore nella maggior parte delle fattrici.

Per questi due elettroliti non vi sono a disposizione kit attendibili per poter effettuare queste misurazioni in campo. Un’approssimazione dell’avvenuta inversione del rapporto tra Na e K si ottiene con la misurazione del pH, per il quale possiamo utilizzare delle pratiche cartine tornasole od anche un phmetro portatile, con un costo contenuto.

Misurazione del pH

La misurazione del pH si effettua in modo rapido, economico e sicuro e necessita di scarsissime quantità di secreto ed è quindi attuabile in pratica anche con soggetti poco collaborativi.

È possibile utilizzare le normali cartine tornasole in vendita nelle farmacie oppure online. Queste devono avere un range tra 5 e 8 e mostrare un chiaro cambiamento di colore tra 7 e 6 (sono i valori che devono essere distinti nel modo più chiaro possibile).

Le variazioni elettrolitiche che determinano nel complesso un abbassamento del pH procedono secondo tre più comuni schemi:

• fattrici primipare giovani: possono passare da un pH 7,5 ad un pH 6,8–6,5 nell’arco di 24–12 ore e poi partorire durante la notte
• fattrici pluripare oppure “old maiden”: di solito il pH si abbassa molto lentamente da 7,5 fino a 6,4–6,2 con andamento non sempre lineare
• fattrici che partoriscono con pH alcalino: evenienza rara ma possibile.

È implicito che queste misurazioni non possono dare delle sicurezze ma sono state concepite per agevolare la gestione dell’allevamento e vanno utilizzate congiuntamente e non in sostituzione di un’attenta osservazione e dell’utilizzo di allarmi elettronici. Sappiamo infatti che il parto nella cavalla deve avvenire in modo rapido ed i primi minuti / le prime ore di vita del puledro devono essere monitorati attentamente per evitare quanto più possibile spiacevoli conseguenze sia per la fattrice che per il redo.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

La maturazione completa del feto equino, indispensabile per permettere al puledro di affrontare la vita extrauterina, avviene nell’ultimo mese di gravidanza. Puledri prematuri (con meno di 320 gg di gestazione) possono essere gestiti nelle unità di terapia intensiva neonatale e sono soggetti a molteplici complicanze in relazione alla mancata maturazione del sistema immunitario, nervoso e tegumentario, oltre a problemi di ossificazione e maturazione cartilaginea che possono gravemente inficiarne il futuro sportivo.

A questo proposito appare molto importante il monitoraggio della gravidanza nelle fattrici, soprattutto nell’ultimo trimestre, per prevenire e trattare tempestivamente tutte quelle condizioni patologiche che possono portare ad una nascita prematura oppure ad un puledro problematico anche se a termine.

Osservazione clinica: alcune patologie medicochirurgiche rappresentano un rischio per il feto (coliche, infezioni virali o batteriche che comportano febbre persistente, decubito prolungato, laminite, gravi zoppie, bolsaggine, anoressia prolungata, etc.) e richiedonoono uno stretto monitoraggio dell’unità fetoplacentare, che può essere effettuata con l’ausilio importantissimo dell’ecografia (transaddominale e transrettale) affiancata alla diagnostica di laboratorio.

Fasi del parto e ruolo degli ormoni

Vediamo quale è il ruolo degli ormoni nelle differenti fasi della gravidanza e quali parametri possono aiutarci nella valutazione delle condizioni del feto equino.

Progesterone / progestinici: aumentano nell’arco della gravidanza, raggiungono un massimo nell’ultimo mese con un picco nelle 24 ore prima del parto a cui segue un crollo repentino, probabilmente in seguito all’attivazione delle surrenali fetali che iniziano la produzione di cortisolo quando l’ambiente uterino non appare più sufficiente alla vita del puledro. L’abbassamento del livello di progesterone promuove il rilascio di prostaglandine e l’attivazione dei recettori per l’ossitocina presenti nel miometrio, processi indispensabili per il regolare svolgimento della fase espulsiva del parto.

Il farmaco normalmente utilizzato per supplementare il progesterone endogeno (altrenogest) non interferisce con la misurazione di questo ormone.

Estrogeni: il loro livello aumenta fino ad un plateau, rimane stabile e poi cala verso fine gravidanza, con picchi notturni ripetuti prima del parto che contribuiscono probabilmente ad attivare il miometrio.

In laboratorio possiamo misurare l’estrone solfato ed l’estradiolo.

Monitoraggio del progesterone

Il corpo luteo ovarico rappresenta la fonte primaria di questo ormone, indispensabile per la quiescenza del miometrio e la chiusura della cervice nei primi 100 gg di gestazione. La presenza di uno o più corpi lutei accessori – successivi alla prima ovulazione – ben vascolarizzati, visualizzabili con ecodoppler, permette una prima valutazione dell’esistenza di una quantità di progesterone sufficiente al mantenimento della gravidanza. La maggiore o minore ecogenicità degli stessi non indica invece la maggiore o minore efficacia secretoria. Il livello ematico di progesterone minimo che permette il mantenimento della gravidanza è di 3 ng/ml. Sono possibili fluttuazioni nell’arco della stessa giornata, quindi si consiglia di effettuare prelievi seriali.

Dopo i 120 giorni, anche l’unità fetoplacentare inizia a produrre questo ormone, tramite uno “scambio” di metaboliti che coinvolge le surrenali fetali e di conseguenza le ovaie perdono di importanza nel mantenimento della gravidanza, quindi, da questa fase in poi, la misurazione di progesterone fornisce una misura affidabile della vitalità fetale. I livelli di questo ormone si mantengono costanti per alzarsi nell’ultimo mese di modo da permettere lo sviluppo della mammella e la maturazione dell’epitelio ghiandolare, che inizia a concentrare colostro ed a produrre i caratteristici cambi nelle secrezioni tipici dell’avvicinamento al parto (ne parleremo in modo approfondito il prossimo mese).

Quando le surrenali fetali sono mature iniziano a secernere cortisolo in risposta allo stress causato da un ambiente uterino non più idoneo, fatto che porterà ad un declino veloce di progesterone, che innesca la perdita del tappo mucoso, l’apertura della cervice, l’inizio delle contrazioni uterine e della fase espulsiva del parto.

Vediamo cosa potrebbe succedere ai livelli di progesterone in caso di disfunzioni dell’unità fetoplacentare, dei corpi lutei nelle fasi iniziali della gravidanza, o di gravi patologie materne.

Monitoraggio: si consiglia di prelevare 3/4 campioni di siero ad intervalli di 48–72 ore per seguire l’andamento fluttuante della secrezione di questo ormone, in questo modo potremmo riscontrare:

• un rapido declino, di solito seguito da espulsione fetale nelle patologie acute
• un aumento precoce seguito da un abbassamento nella sofferenza fetale o nelle placentiti, con rischio di nascita di puledri prematuri
• assenza di un aumento di progesterone nell’ultimo mese di gravidanza nelle fattrici con insufficienza placentare o patologie uterine che determinano una gestazione prolungata (oltre i 400 gg) con nascita di puledri dismaturi.

Monitoraggio degli estrogeni

Questa categoria di ormoni richiede la presenza dell’unità fetoplacentare per la propria produzione. L’estrone solfato infatti può essere utilizzato per la diagnosi di gravidanza nella fattrice oltre i 100 giorni quando l’ecografia non appare un’opzione praticabile: mentre il solo progesterone nelle prime fasi di gravidanza potrebbe essere espressione di un corpo luteo persistente, la presenza di estrogeni (estrone solfato) indica con sicurezza uno sviluppo fetale.

Il loro livello aumenta e segue lo sviluppo delle gonadi fetali, che forniscono i precursori sia di estrone solfato che di estradiolo. Entrambi si innalzano fino ad un plateau durante la gravidanza, per poi calare gradualmente seguendo la maturazione delle gonadi fetali fino al parto. Sembrano esserci dei picchi notturni di estrogeni nei giorni che precedono il parto, probabilmente per preparare i recettori del miometrio all’azione dell’ossitocina e delle prostaglandine.

Monitoraggio: si consiglia anche in questi casi di effettuare più prelievi nel corso della gravidanza. Livelli totali di estradiolo ed estrone solfato > a 1000 ng/ml sono considerati segno di benessere fetale, valori tra i 500 e gli 800 ng/ml potrebbero indicare sofferenza fetale, valori < a 500 ng/ml farebbero pensare ad una grave compromissione fetale. L’estrone solfato da solo non appare adatto per il monitoraggio della funzione placentare a causa della sua emivita piuttosto lunga e dal fatto che i suoi livelli si abbassano drasticamente in corrispondenza di morte fetale, poco prima di un’eventuale espulsione, non lasciando quindi spazio per interventi terapeutici.

Siero amiloide

Sappiamo che, in corso di patologie placentari, gli esami ematologici standard (conta cellulare completa e parametri biochimici di base) sulla fattrice non ci aiutano poiché raramente risultano alterati. L’unico parametro che si innalza precocemente nel caso di infezione/infiammazione appare appunto la siero amiloide che, per le caratteristiche di rapidità e precocità di variazione, costituisce un valido ausilio nel monitoraggio della terapia. I valori normali negli ultimi mesi di gestazione devono rimanere inferiori a 7 mg/l ed innalzarsi in corrispondenza del parto, per poi abbassarsi velocemente se non vi sono complicanze degne di nota.

Con un quadro clinico di sofferenza placentare, il monitoraggio di questo parametro permette di valutare la risposta alle terapie antibiotiche ed antinfiammatorie, permettendo un cambio di rotta repentino in caso di mancanza di efficacia delle molecole utilizzate.

(… segue il prossimo mese)

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Negli ultimi anni hanno acquisito sempre maggiore importanza gli ausili diagnostici e terapeutici non invasivi, è questo il motivo per cui i biomarker stanno acquisendo sempre maggiore importanza nel processo diagnostico anche in medicina veterinaria. I biomarker sono composti misurabili che possono essere utilizzati come indicatori per vari processi fisiologici o patologici e quindi hanno un sicuro significato prognostico e diagnostico. In alcuni casi possono fornire delle importanti informazioni aggiuntive per un esame clinico completo e possono quindi contribuire a prendere le corrette decisioni mediche. I biomarker molecolari possono essere misurati in campioni biologici (come siero, plasma o liquido cerebrospinale) e si tratta di molecole specifiche, enzimi od ormoni.

I biomarker vengono utilizzati specialmente nella diagnostica dei tumori come strumenti utili e non invasivi per la diagnosi, la prognosi ed il monitoraggio della terapia. Nella medicina equina, la diagnostica neoplastica sta diventando sempre più importante a causa dell’aumento dell’età media della popolazione equina ed è tuttora un sfida per il clinico di campo a causa delle limitate possibilità di diagnostica per immagini nel cavallo (torace, addome) per via dei grossi diametri di questi distretti. Inoltre i pazienti equini sofferenti per patologie neoplastiche tendono a mostrare una sintomatologia non specifica come febbre, cachessia o una leggera anemia, la conta dei bianchi spesso si altera solo leggermente e le sindromi paraneoplastiche (come l’ipercalcemia) sono raramente presenti. Questa situazione potrebbe rendere estremamente difficoltoso giungere ad una diagnosi; il linfoma equino (linfosarcoma) rappresenta la patologia tumorale maligna più comune nel cavallo e può manifestarsi nella forma gastroenterica, cutanea, mediastinica o multicentrica (Fig.1).

A seconda della fase della malattia e della localizzazione del tumore potrebbe non essere effettuabile un campionamento adeguato per una diagnostica istopatologica.

Si è iniziato recentemente ad usare la timidina chinasi come marker per le patologie proliferative nella diagnostica dei tumori equini. Si tratta di un enzima cellulare che gioca un ruolo decisivo durante la sintesi di DNA, quando il nucleoside timidina viene incorporato nel DNA; questo è il motivo per cui la sua concentrazione nel siero è correlata in modo positivo diretto con il tasso di divisione cellulare. Dal momento che le patologie maligne del sistema ematopoietico e linfatico (linfoma, leucemia e mieloma multiplo) sono caratterizzate da un elevato tasso proliferativo, la timidina chinasi può essere misurata utilizzandola come un cosiddetto marker proliferativo. Bisogna tener conto nelle diagnosi differenziali che un’infiammazione grave potrebbe portare ad un leggero aumento della timidina chinasi, in questo caso dovrebbero essere valutate anche anche le proteine di fase acuta.
Un risultato negativo potrebbe non escludere comunque la presenza di una malattia tumorale sottostante.

L’elettroforesi delle proteine sieriche potrebbe costituire un’opzione diagnostica aggiuntiva a basso costo in caso di sospetto tumorale. Le alterazioni monoclonali, spesso riguardanti la frazione beta o gamma, rappresentano il risultato della produzione eccessiva di una specifica immunoglobulina da parte di una plasmacellula clone e sono state descritte nelle malattie linfoproliferative (Fig. 2 A e B).

L’eczema estivo è la più comune condizione pruriginosa cutanea del cavallo. I sinonimi di questa patologia sono “ipersensibilità al morso d’insetto (IBH)”, ipersensibilità agli insetti, “dolce prurito” ma vengono ancora usati i termini classici “eczema estivo” o anche “rogna estiva”. Il prurito deriva da una parte dalla puntura dell’insetto stesso e dall’altra parte dall’ipersensibilità di tipo 1 all’allergene presente nella saliva degli insetti.

Gli insetti responsabili sono i moscerini ematofagi (Culicoides), i simulidi (Simulium), le mosche (Stomoxys, Musca), le zanzare (Culex) e i tafani (Tabanus). In uno studio, il 75% dei cavalli ha reagito ai culicoidi e ai Simulium, fatto che fa pensare ad una cross-reattività.

Questo sospetto è supportato anche da uno studio che ha dimostrato che in Simulium vittatum e Culicoides nubeculosus è presente un antigene omologo nelle ghiandole salivari di entrambi gli insetti.
La tendenza a sviluppare una ipersensibilità agli insetti dipende da diversi fattori (ad es. geni, posizione geografica). In alcune razze si verifica con maggiore probabilità una ipersensibilità agli insetti, ma tuttavia la malattia può colpire qualunque razza e a qualunque età.
Il motivo principale per cui in Islanda i cavalli non presentano questa malattia è che il Culicoides non è presente, quindi risulta assente uno dei principali responsabili di questa malattia. Animali nati in Islanda e importati in Europa avranno un’incidenza di anche più del 50% (!) di ammalarsi di questa allergia, mentre, al contrario, la loro prole avrà un’incidenza inferiore al 10%. In un altro studio, il 34,5% di 330 cavalli, importati dall’Islanda in Danimarca, ha mostrato la comparsa di IBH. Due anni dopo, quel numero è passato al 49,5% e in zone con forte infestazione di zanzare addirittura al 54%. Cavalli islandesi, importati dall’Islanda negli USA, non hanno mostrato nessun sintomo durante la prima estate, ma nel corso della seconda estate il 56% degli animali era sintomatico.
Al contrario, solo il 4,6% di 1192 cavalli islandesi, nati in zone tedesche, dove il Culicoides è endemico, soffrova di eczema estivo. Se entrambi i genitori soffrivano di IBH, la prevalenza arrivava al 12,2% e diminuiva al contrario al 6,5% se un solo genitore era malato. Tuttavia, se nessuno dei due genitori era colpito dalla malattia, la prevalenza era del 2,9%.

Le infezioni da parassiti ematici nel cavallo causano l’insorgenza di due sindromi principali di carattere sia acuto che cronico, con ricadute pesanti sulle performance sportive e sulla condizione fisica generale del soggetto colpito: la piroplasmosi e l’ehrlichiosi equina, causate da un gruppo di agenti eziologici (protozoi o batteri intracellulari) trasmessi da artropodi vettori (principalmente Ixodes, Hyalomma, Rhipicephalus e Dermacentor) che si localizzano nelle ghiandole salivari dopo un pasto di sangue infetto. È descritta inoltre la trasmissione iatrogena tramite emotrasfusioni, interventi chirurgici o utilizzo di aghi non sterili.

Dopo l’ingresso negli eritrociti (o nei linfociti periferici nel caso di Anaplasma ph.) questi agenti possono rimanere quiescenti o manifestarsi nella forma acuta con emolisi massiva e gravi alterazioni delle cellule ematiche, fatto che da origine alla gran parte della sintomatologia clinica. Da ricordare che Theileria equi presenta anche una fase del ciclo linfocitaria (nei linfociti e monociti periferici), per questo motivo l’eliminazione completa di questo parassita appare ardua anche dopo trattamento, mentre Babesia caballi e Anaplasma ph. possono venire eliminati dopo terapia. I portatori sani di questi microrganismi fungono da serbatoio per successive reinfezioni nelle zone infestate dalle zecche vettore.

Sono colpiti cavalli, asini, muli e zebre. La maggiore incidenza si rileva in autunno e primavera, soprattutto in conseguenza di competizioni o trasporti. Il periodo di incubazione varia da 8 fino a 30 giorni.

La sintomatologia è aspecifica: febbre, anoressia, depressione, atassia, zoppie, edema degli arti, seguiti da anemia ed ittero. Le forme croniche possono essere ancora più subdole con debolezza, coliche ricorrenti, calo della performance, rigidità muscolari, lieve anemia. L’ittero e la febbre potrebbero non rilevarsi perché solitamente di breve durata od intermittenti.

Per tutte queste patologie possiamo riscontrare i seguenti rilievi ematologici comuni:

• esame emocromocitometrico completo: anemia rigenerativa di solito lieve unitamente a trombocitopenia con leucopenia seguita da leucocitosi in fase tardiva
• striscio ematico: presenza di merozoiti caratteristici negli eritrociti (o corpi inclusi nei granulociti per Anaplasma ph.) in corso di parassitemia importante
• profilo biochimico: aumento deciso di bilirubina indiretta, fibrinogeno, a volte enzimi epatici ed un generale abbassamento delle proteine totali.

Vediamo in dettaglio questi emoparassiti e come utilizzare efficacemente il laboratorio per ottenere una diagnosi e impostare la corretta terapia, che cambia a seconda dell’agente eziologico coinvolto. Sono possibili forme miste caratterizzate dalla contemporanea presenza in circolo di più di un parassita.

Piroplasmosi equina

Si tratta della patologia da emoparassiti più severa, caratterizzata da febbre, emolisi intravascolare, ittero ed occasionalmente emoglobinuria e mioglobinuria, coliche ricorrenti e disordini digestivi. Le forme iperacute gravi possono portare a morte il soggetto colpito se non trattate; si riscontrano frequentemente forme croniche caratterizzate da perdita di peso, anoressia, splenomegalia, calo delle performance sportive.

Gli agenti eziologici responsabili di questa sindrome sono Theileria equi e Babesia caballi, protozoi intracellulari che si localizzano principalmente negli eritrociti causandone la lisisebbene T. equi possa rilevarsi e permanere occasionalmente nelle cellule della serie bianca, per questo motivo la completa sterilizzazione dei soggetti positivi a questo parassita appare difficoltosa.

È inoltre descritta nel cavallo la trasmissione diretta transplacentare, anche se non molto frequente, causa di aborto o ittero nel neonato.

Vediamo ora quale test scegliere per ottimizzare il successo diagnostico, a seconda di quale quadro clinico ci troviamo di fronte.

Forme acute

Sono caratterizzate da un esordio molto rapido ed invalidante, con febbre elevata, ittero seguito da anemia, debolezza, anoressia, tachicardia e tachipnea gravi. Gli esami ematologici mostrano di solito un’anemia rigenerativa molto spinta ed una iperbilirubinemia con bilirubinuria e generale leucopenia.

Una volta superata la fase acuta i soggetti possono rimanere portatori sani anche dopo ripetuti trattamenti con imidocarb dipropionato, in quanto il farmaco agisce nel ridurre la sintomatologia acuta piuttosto che eliminare completamente il parassita.

In questa fase i test diagnostici maggiormente indicativi sono:

• striscio ematico: trovandoci di fronte ad un animale con febbre alta significa che la parassitemia è importante e quindi la possibilità di ritrovare i parassiti con il caratteristico aspetto piriforme a due (iB. caballi) o a croce di quattro (T. equi) all’interno degli eritrociti è più elevata. Si tratta di un esame rapido e poco costoso che vale sempre la pena effettuare in campo. Se non si ritrovano i merozoiti non è comunque possibile escludere la malattia.
• PCR: per gli stessi motivi anche una amplificazione del DNA del parassita effettuata su sangue intero in EDTA ha buone probabilità di avere un esito diagnostico favorevole. In Laboklin effettuiamo una prima PCR che con un esito positivo permette una seconda differenziazione eziologica tra Theileria / Babesia, processo indispensabile per dosare efficacemente l’unico farmaco disponibile: per trattare Theileria equi serve infatti un dosaggio doppio con più somministrazioni ripetute.

Test sierologici: sono disponibili tre tipologie di test anticorpali:

• immunofluorescenza diretta (IFAT): si tratta del test più rapido e meno costoso, molto sensibile e quindi preferito quando vi è un animale che richiede una pronta terapia in fase acuta
• ELISA / fissazione complemento (FC): sono utilizzate usualmente per l’export negli Usa, hanno un costo e una tempistica maggiore rispetto all’IFAT.

Forme croniche

In questi casi i rilievi generici di laboratorio possono essere poco conclusivi: si riscontra infatti una lieve anemia ed una bilirubina appena sopra il limite superiore con leucociti nella norma. Anche la sintomatologia è spesso vaga e comune a molte altre patologie che vanno quindi escluse: calo della performance, rigidità muscolari, zoppie intermittenti, disoressia, colichette, debolezza.

Se ne deduce che sia l’esame dello striscio che la PCR su sangue in EDTA possono risultare negative, essendoci una parassitemia lieve ed intermittente.

Test sierologici: sono utilizzabili sia IFAT che ELISA che FC. Essendoci un livello di parassiti in circolo molto basso ed intermittente potremmo avere un titolo basso che però non si negativizza mai; oppure un titolo elevato od una sieroconversione in caso di pregresso episodio acuto recente. Ne consegue che è il clinico a dover stabilire in base all’anamnesi, alla visita clinica ed agli esami ematologici di base in quale fase della malattia si trova il soggetto preso in esame, non può essere un test di laboratorio a fornirci questa valutazione.

Puledri neonati: dobbiamo ricordare che nelle prime ore dopo la nascita avviene la trasmissione di anticorpi di origine materna tramite il colostro al puledro, quindi prima dei 4–5 mesi di vita questi test non sono indicativi di infezione se si sospetta una trasmissione transplacentare. In caso di sospetto nel puledro sintomatico con madre positiva appare quindi indicato uno striscio o una PCR.

Se invece il puledro è sieropositivo per presenza di anticorpi materni, si sieronegativizzerà dopo il 4°-5° mese di vita.

Anaplasma phagocytopilum (ex Ehrlichia equi)

E’ un batterio intracellulare gram negativo responsabile della sindrome meno grave e di solito autolimitante, l’ehrlichiosi equina. È accumunata alla piroplasmosi equina dal quadro clinico e dai meccanismi patogenetici coinvolti che sono sovrapponibili.

Dopo l’infezione ad opera di una zecca portatrice, i batteri raggiungono il circolo localizzandosi principalmente nei neutrofili e negli eosinofili, causando un’iniziale neutropenia e alterazioni importanti della funzionalità delle cellule della serie bianca, piastrinopenia, vasculite, ed emolisi.

La sintomatologia è di solito lieve e aspecifica, caratterizzata da febbre altalenante, calo di performance, debolezza e rigidità, anemia e leggero ittero, zoppie intermittenti, laminite.

Questo agente eziologico può presentarsi congiuntamente a Babesia o Theileria in quanto ospite degli stessi artropodi vettori. Il trattamento prevede la somministrazione di tetracicline per via endovenosa per alcuni giorni, con minori effetti collaterali rispetto all’imidocarb.

Vediamo quali test abbiamo a disposizione per la diagnostica di questa patologia.

• striscio ematico: è possibile visualizzare la presenza dei caratteristici corpi inclusi citoplasmatici nei granulociti, valgono tutte le limitazioni precedentemente esposte per la piroplasmosi
• PCR: è una metodica che permette una diagnosi rapida e precisa in fase pre-sintomatica (dopo i 5 giorni post infezione) e acuta fino a 7 giorni dopo la rilevazione dei primi sintomi; si effettua su sangue intero in EDTA e sulla zecca, qualora rilevata sull’animale
• test sierologici (IFAT): le IgG vengono rilevate in circolo dopo circa 7–10 giorni dall’infezione, quindi dopo l’insorgenza dei primi sintomi e permangono per molto tempo dopo un primo contatto, quindi per una diagnostica precisa in fase acuta si consiglia una sieroconversione dopo 15/30 giorni; la somministrazione di tetracicline può però influire negativamente sulla produzione di anticorpi.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Nell’ultimo mese la movimentazione degli equini sportivi in tutta Europa ha subito delle pesanti limitazioni a causa dei recenti casi di Herpesvirus equino, precisamente di un ceppo neuropatogeno del sierotipo 1 che si è dimostrato particolarmente diffusivo.

Esistono 5 sierotipi conosciuti di Herpesvirus equino: le varianti 1 e 4 appaiono correlate geneticamente e responsabili di quadri clinici patologici simili. In particolare la variante EHV1 ha dimostrato di poter causare, oltre alla consueta forma respiratoria, anche aborto, natimortalità, vasculite, uveite e la grave forma neurologica denominata Mieloencefalopatia da Herpesvirus equino (EHM). Entrambi questi sierotipi sono inoltre in grado di produrre forme latenti con periodiche rivirulentazioni – con o senza sintomatologia evidente che creano i cosiddetti soggetti “diffusori asintomatici”, piuttosto difficili da rilevare, ma che svolgono un’importanza strategica cruciale nella diffusione del virus.

Il contagio avviene principalmente tramite l’aerosol delle secrezioni respiratorie, con contatto diretto tra soggetti ma anche indirettamente tramite fomiti e persone che possono veicolare il virus venendo in contatto con secrezioni, liquidi ed invogli fetali abortiti. Il virus può permanere sulle superfici anche una settimana, fortunatamente è sensibile alla maggior parte dei detergenti e disinfettanti e non è responsabile di zoonosi.

La prima porta di ingresso del virus è la mucosa nasale, dove si deposita ed entra rapidamente nelle cellule dell’epitelio nasale, moltiplicandosi attivamente e proteggendosi in questo modo dall’azione degli eventuali anticorpi circolanti. Di seguito si diffonde nell’organismo causando viremia già dopo 12 ore. I primi sintomi (febbre altalenante, tosse, scolo oculonasale mucoide, inappetenza, ingrossamento dei linfonodi) appaiono di solito dai 2 ai 10 giorni dopo l’infezione: questa fase può passare inosservata nei soggetti vaccinati o che hanno già avuto un contatto con il virus nell’arco della loro vita. Può seguire l’aborto nelle fattrici gravide, causato da trombosi ed infezione endoteliale dei vasi placentari, con viremia e morte fetale improvvisa. Questa evenienza può verificarsi dopo un tempo variabile da 2 settimane fino a tre mesi dopo l’infezione, preferibilmente verso fine gravidanza (10° – 11° mese di gestazione).

La forma neurologica invece si sviluppa se sono colpite le cellule endoteliali dei microcapillari che circondano il midollo allungato ed il cervello, causando una rottura della barriera vascolare che, assieme alla viremia persistente, permette al virus di localizzarsi in questo distretto. I danni sono dovuti sia all’azione diretta del virus sugli endoteli vasali che alla formazione di immunocomplessi e microcoaguli che peggiorano la vasculite e causano infine una grave encefalomalacia necrotica, responsabile dei deficit neurologici. I sintomi principali sono incoordinazione, letargia, difficoltà ad urinare o incontinenza, paralisi flaccida della coda ed insensibilità della cute degli arti posteriori. In alcuni casi si rileva una paralisi completa del posteriore con decubito permanente, per cui si richiede l’eutanasia.

I soggetti che sviluppano la forma neurologica di solito mostrano minor sintomatologia respiratoria ma picchi più alti di febbre e viremia, cosa che si è visto agevolare l’ingresso del virus nel sistema nervoso. I sintomi neurologici peggiorano rapidamente nell’arco delle prime 24/48 ore. Nei soggetti che superano la malattia il miglioramento dei deficit è comunque lento e richiede lunghe terapie di supporto.

Sono possibili reinfezioni in quanto l’immunità (anche vaccinale) è parziale e di breve durata (4–6 mesi). Abbiamo già affermato che il virus dopo un primo contatto può permanere in forma latente localizzandosi anche per lungo tempo nelle cellule della serie bianca, pronto a rivirulentarsi in caso di stress, trasporti, surmenage atletico, gravidanza e/o parto: in queste occasioni il cavallo diventa escretore per periodi variabili dai 7 fino ai 28 giorni, con o senza sintomatologia concomitante.

La forma neurologica è prevalentemente causata da una mutazione neuropatogena del gene ORF30 di un ceppo del tipo 1 (denominato D752) che lo rende dotato di spiccato neurotropismo. Va considerato che anche alcuni ceppi 4 e il ceppo 1 senza mutazione (chiamato N752) possono comunque determinare, in soggetti predisposti, questa grave complicanza.

Test sierologici

Metodica ELISA su siero

La produzione di anticorpi circolanti (IgM ed IgG) avviene dopo circa una settimana dal contatto virale, conseguentemente alla prima viremia. Molti soggetti vengono in contatto con il virus addirittura al momento del parto o dello svezzamento sviluppando lunghi periodi di latenza, quindi per una corretta diagnosi sierologica dobbiamo valutare l’eventuale sieroconversione, ovvero il deciso aumento del titolo in un arco temporale di 14–21 giorni, indice di contatto e replicazione virale recente, procedendo come segue:

• un primo prelievo in fase acuta, ovvero tra 1 e 3 giorni dall’insorgenza dei primi sintomi respiratori
• un secondo prelievo in fase convalescente (dalle 2 alle 4 settimane dopo il primo prelievo)
• confronto del titolo anticorpale: deve essere aumentato di almeno di 2 volte.

Una semplice positività, anche a titolo elevato superiore alla soglia data dal laboratorio, non permette una diagnosi di sicurezza.

Nella forma abortiva non è possibile effettuare una sieroconversione in quanto l’espulsione del feto avviene successivamente alla forma respiratoria e quindi il siero prelevato in questo momento è da considerarsi già convalescente.

Isolamento virale

PCR su tampone nasale

Si tratta della metodica che permette di stabilire se un soggetto – anche asintomatico – possa essere escretore del virus: viene infatti rilevata la presenza di parti di DNA virale sulla mucosa nasale che, come sappiamo, è sia la porta di ingresso che di escrezione del virus nell’animale malato. È possibile utilizzare un normale tampone da batteriologia, avendo cura di NON immetterlo nell’apposito contenitore con il medium, ma di tagliarlo ed immetterlo in una provetta vuota / contenitore sterile (tappo rosso o nero), senza alcuna aggiunta.

Si tratta di una PCR qualitativa e non è possibile quantizzare il carico virale: le linee guida di biosicurezza europee (ECEIM – BEVA) prevedono comunque la quarantena di un positivo escretore, a prescindere dall’entità dell’escrezione.

Metodica di esecuzione:

• pulire le narici per evitare contaminazione da polvere o sporcizia
• introdurre il tampone profondamente in entrambe le narici, avendo cura di evitare la falsa narice
• girare il tampone più volte, avendo cura di toccare le pareti del meato nasale in tutte le direzioni, in modo da permettere alle secrezioni di imbibire il cotone
• estrarre il tampone e introdurlo nel contenitore a secco

È possibile utilizzare un tampone per singola narice: i due tamponi verranno conteggiati come singolo test (ovviamente se appartenenti al medesimo soggetto).

Laboklin dispone di un pacchetto PCR apposito comprendente sia EHV1 (con la differenziazione del ceppo neuropatogeno) che EHV4 a prezzo particolarmente conveniente.

PCR su sangue in EDTA

Il sangue rappresenta un materiale idoneo se utilizzato su animali sintomatici con febbre e viremia, oppure per i cavalli colpiti dalla forma neurologica che possono non mostrare sintomi respiratori. La ricerca del DNA virale viene effettuata lisando le cellule della serie bianca.

Metodica di esecuzione: si tratta di effettuare un normale prelievo di sangue in EDTA come per un esame emocromocitometrico, non sussistono particolari raccomandazioni per la conservazione del campione e questo materiale può essere spedito senza ulteriori accorgimenti.

PCR su liquor

L’esecuzione di questo test su liquido cefalorachidiano è indicata per i cavalli affetti dalla forma neurologica, sia in vita che postmortem.

La presenza del virus in questo materiale non è frequente anche in presenza di sintomatologia nervosa grave, in quanto il danno vascolare ed immunomediato interessa prevalentemente i vasi perineuronali e la penetrazione del virus nel tessuto nervoso si verifica solo con un danno endoteliale importante con formazione di microtrombi, microemorragie, edema e necrosi ischemica massiva del tessuto nervoso.

Per questo motivo si consiglia di abbinare alla PCR anche un esame completo del liquor, a integrazione della procedura diagnostica, con particolare attenzione per la rilevazione di:

• iperproteinemia con conta cellulare normale
• xantocromia (per denaturazione dell’eme)
• presenza di eritrociti, anticorpi e leucocitosi ma solamente quando il danno vascolare è molto esteso.

PCR su feto ed invogli

In caso di aborto è possibile inviare al laboratorio parti di tessuti patologici come invogli fetali e placenta, immettendoli in soluzione fisiologica oppure effettuando tamponi a secco sulle lesioni riscontrabili, in parallelo ad uguale materiale immesso in formalina per l’istologia. I tessuti fissati non possono essere sottoposti a PCR ma possono confermare la presenza delle caratteristiche lesioni necrotioischemiche (corpi inclusi intranucleari eosinofili) sia a livello di timo, polmone, fegato, milza del puledro che degli invogli.

PCR su tessuti da necroscopia

Nei soggetti adulti, venuti a morte, affetti dalla forma respiratoria o abortiva, le indicazioni per la raccolta dei tessuti diagnostici sono gli stessi elencati per i feti abortiti, sia per quanto riguarda l’esecuzione di PCR che per l’istologia.

Per i soggetti colpiti dalla forma neurologica sono indicati invece un esame del liquor (biochimico ed una eventuale PCR), una PCR su tessuti nervosi immessi in soluzione fisiologica ed un esame istologico di parti di tessuto cerebrale e midollo allungato posti in formalina al 5%. Le lesioni tipiche di questo distretto sono costituite da un’encefalomalacia necrotica causata dalla vasculite trombotica dei piccoli vasi con estesi manicotti perivascolari di infiltrati linfocitari causata dal virus.

La possibilità di effettuare una veloce ed affidabile diagnosi dei casi conclamati, unitamente all’attuazione di stretti protocolli di isolamento degli infetti con un’attenta igiene nella gestione delle scuderie, oltre alla predisposizione di un’idonea quarantena con controllo della temperatura (sospetta oltre i 38,3°C), in parallelo all’esecuzione di tamponi o test sierologici ad intervalli di 7/14 giorni nei soggetti anche asintomatici, permette di arginare la diffusione del virus.

Per ulteriori indicazioni si consiglia di visionare le apposite note ECEIM e CeRMe che forniscono chiare direttive logistiche per il controllo della diffusione degli Herpesvirus equini.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

ECov – una malattia virale emergente

In quanto veterinari siamo consapevoli dell’importanza delle malattie virali emergenti, specialmente quando si diffondono rapidamente e le opzioni terapeutiche appaiono limitate.

I Coronavirus equini sono conosciuti da tempo come agenti causali di diarrea nel puledro, tuttavia sono stati recentemente associati anche a patologie nel cavallo adulto. Si tratta infatti di virus a RNA, monofilamento, non segmentati, dotati di envelope, appartenenti alla famiglia dei Coronaviridae, che si ritrovano in numerosi mammiferi ed uccelli, causando varie patologie enteriche, respiratorie, epatiche o neurologiche.

Il Coronavirus equino (ECoV) è classificato appartenente al genere Betacoronavirus 1, assieme al Coronavirus bovino (Bcov). ECov è comunque geneticamente distinto dal SARS – CoV2 umano, e nessuna evidenza indica che i cavalli possano contrarre o diffondere il SARS – CoV2 ad altri animali o all’uomo. Il periodo di incubazione dell’ ECoV è corto. E’ stato dimostrato che l’RNA dell’ECoV può essere rilevato già 72–96 ore post-inoculazione e continua ad essere rilevabile fino a 10–14 giorni post-infezione. Gli studi hanno anche dimostrato una via di trasmissione fecal-orale.

Nella clinica ippiatrica abbiamo a disposizione alcuni vaccini per la prevenzione di patologie virali e batteriche; questi protocolli vaccinali possono interferire nella diagnostica sierologica anticorpale – vediamo come e per quali malattie.

Principi generali

Un vaccino non fa altro che veicolare l’antigene di un patogeno mettendolo in contatto con le cellule linfoidi nei linfonodi tramite il sistema linfatico o nella milza, tramite il circolo sanguigno. I linfociti B inglobano l’antigene che gli viene presentato, interagiscono coi linfociti T e cominciano a produrre anticorpi (prima IgM, poi IgG, IgA, IgE) diventando plasmacellule; in seguito alcuni linfociti B diventano “memory cell” pronte ad attivarsi se nuovamente esposti al medesimo antigene. Anche alcuni linfociti T, incontrando gli stessi antigeni, si attivano in aiuto dei linfociti B nella modulazione della risposta immunitaria (linfociti T helper): alcuni di questi diventano linfociti T “memory”, preparati per affrontare un’eventuale infezione naturale.

Adiuvanti

La stimolazione antigenica data dal vaccino viene amplificata dagli adiuvanti nel caso di un vaccino spento, che cioè non replica nell’organismo e che quindi potrebbe non venire in contatto con molte cellule linfoidi. Gli adiuvanti sono sostanze che promuovono l’infiammzione nel sito di inoculo, per richiamare più cellule possibili, che poi presenteranno l’antigene ad un maggior numero di linfociti, ottimizzando ed amplificando quindi Ia risposta immunitaria.

Le sostanze utilizzate principalmente come adiuvanti sono: sali di alluminio, emulsioni, particelle lipidiche, nanoparticelle, polielettroliti, immunopotenziatori (proteine, glicosidi).

Vaccini

I principali vaccini studiati per il cavallo sono di varia tipologia:

• vivi attenuati: sono prodotti inattivando l’agente eziologico che perde quindi la sua patogenicità, conservando nel contempo la piena immunogenicità, anche attraverso un’attiva replicazione all’interno dell’ospite, senza peraltro causare la malattia.
• inattivati: sono composti dagli agenti eziologici uccisi tramite calore, formaldeide, irradiazione; per questo motivo sono meno immunogeni ed usualmente abbinati ad adiuvanti per permettere una maggior reattività immunologica.
• a subunità proteiche: contengono le porzioni proteiche degli agenti eziologici o delle tossine che producono una forte risposta immunitaria senza altre azioni patogene nei confronti dell’ospite; sono di solito addizionati adiuvanti.
• ricombinanti: sono composti da un antigene “innestato” su un virus vettore sicuramente non patogeno per il cavallo (poxvirus del canarino ad esempio), che replica contribuendo alla produzione di una forte risposta immunitaria, sia umorale che cellulo-mediata.
• a DNA: sono prodotti inserendo la sequenza genica che codifica per alcune proteine virali di superficie in plasmidi batterici che colonizzano la cellula linfocitaria facendole produrre essa stessa la proteina immunogena. Questa di seguito viene esposta dalle stesse cellule del sistema immunitario determinando una rapida attivazione sia umorale che cellulomediata.
• chimerici: sono composti da più sequenze geniche che codificano per differenti proteine dell’envelope o del capside virale.

Vediamo in dettaglio per ogni vaccino disponibile sul mercato italiano le tempistiche di somministrazione, di insorgenza e durata dell’immunità vaccinale, per una corretta interpretazione dei corrispettivi test sierologici disponibili.

Tetano

Si tratta di una patologia grave causata da Clostridium tetani. Il microrganismo penetra attraverso ferite cutanee, anche di lieve entità, in contatto con il terreno dove le spore del batterio sono abbondanti. Dopo l’infezione il microrganismo inizia a produrre la tossina che, raggiungendo il sistema nervoso periferico e poi centrale, è la responsabile della sintomatologia neurologica paralitica che porta quasi inevitabilmente alla morte il soggetto colpito.

Il vaccino viene allestito con il tossoide tetanico (od anatossina), che sarebbe la parte immunogena della tetanospasmina, priva del suo potere tossico.

Se invece si ha necessità di protezione immediata, è possibile somministrare entro 24 ore dall’evento a rischio (ferita, chiodo nello zoccolo, parto…) il siero iperimmune antitetanico, contenente le immunoglobuline già pronte, prodotte da un soggetto vaccinato, con un effetto protettivo da 24-48 ore dopo somministrazione intramuscolare ed immediatamente dopo somministrazione endovenosa, fino a circa 20 giorni post inoculo.

Nel frattempo, nei soggetti adulti è anche possibile somministrare il vaccino contemporaneamente al siero iperimmune, in parti muscolari differenti, a completamento della protezione immunitaria.

Protocollo: il tossoide tetanico è disponibile in Italia unicamente abbinato al vaccino contro l’influenza equina.

1. somministrazione: intorno al 5° mese di vita
2. somministrazione: dopo 4 – 6 settimane
3. somministrazione: dopo 12/18 mesi.

Titolo anticorpale: permane per almeno 2/3 anni dopo il completamento delle vaccinazioni di base ed in alcuni casi anche di più

Test anticorpale: Laboklin dispone di un test sierologico (ELISA semiquantitativa) che permette la quantizzazione del titolo anticorpale per l’anatossina tetanica, che può essere utilizzato per il monitoraggio della copertura vaccinale.

Influenza equina

E’ una malattia virale causata da un virus della famiglia degli Orthomyxoviridae molto contagiosa per il cavallo, caratterizzata da una sintomatologia prevalentemente respiratoria, anche se sono possibili le complicanze gastroenteriche. Il virus si trasmette per via aerea attraverso tosse, scoli e starnuti. I soggetti colpiti si ammalano nell’arco di 1/3 giorni, con febbre e sintomi respiratori e superano generalmente l’infezione nell’arco di una settimana, salvo complicazioni polmonari. La malattia è molto diffusiva e per questo motivo il completamento di un corretto piano vaccinale è richiesto per tutti gli equini che vengono movimentati per l’uso sportivo.

Protocollo: i vaccini disponibili in Italia comprendono anche il tossoide tetanico ed i ceppi: A/2South africa, A/2Newmarket, A/2Kentucky, A/2Brentwood, A/2Borlange.

Si tratta di vaccini ricombinanti od attenuati, da utilizzarsi secondo questo protocollo:

1. somministrazione: intorno al 5°/6° mese di vita
2. somministrazione: dopo 4–6 settimane
3. somministrazione: dopo 12 mesi

Titolo anticorpale: permane stabile per circa 6 mesi dopo il completamento delle vaccinazioni di base, fino a non più di un anno. Questo perché i ceppi utilizzati sono generalmente vecchi ed i virus antinfluenzali sono soggetti ad un rapido “shift antigenico”, quindi la copertura appare minore rispetto al titolo anticorpale prodotto dall’infezione naturale.

Test anticorpale: Laboklin offre un test anticorpale (Inibizione dell’emoagglutinazione – per i ceppi A/1Prague e A/2 Newmarket) anche se in letteratura non vi sono dati concordanti nello stabilire quale sia il titolo effettivamente protettivo. Per una corretta diagnosi è quindi necessario valutare una sieroconversione dopo 10–14 gg.

Rabbia

E’ una grave malattia causata da un virus del genere Lyssavirus, caratterizzata da una sintomatologia nervosa a decorso mortale, trasmissibile anche all’uomo. Il virus si localizza nel sistema nervoso centrale e viene escreto dalle ghiandole salivari, permettendo il contagio tramite il morso o tramite contatto con la saliva di soggetti infetti. Dopo una fase variabile, anche molto lunga, di incubazione, possiamo avere una fase detta prodromica (caratterizzata da neurite nella sede della ferita) seguita dalla fase neurologica, che nel cavallo può assumere varie caratteristiche atipiche, non specifiche: turbe del comportamento e della personalità, iperattività ed aggressività, pica, ma anche semplice astenia, zoppie od atassia, spasmo del faringe (idrofobia) con conseguente scialorrea ed alterazioni della fonesi, che evolvono rapidamente in paralisi e morte. Nessuna terapia appare possibile. L’Italia è attualmente paese indenne dal 2013, la profilassi antirabbica è consigliata a scopo precauzionale negli animali al pascolo nelle zone di confine interessate dagli ultimi casi (Friuli Venezia Giulia, province di Belluno, Trento e Bolzano). È stata inoltre mantenuta, sempre in queste zone, la vaccinazione orale nelle volpi.

I vaccini disponibili per il cavallo sono costituiti da virus inattivato, lo schema di somministrazione è il seguente:

1. somministrazione: dopo il 6°mese di vita
2. somministrazione: dopo 1/2 anni, a seconda del prodotto utilizzato

Titolo anticorpale: permane per circa 1/2 anni, anche 3 per alcuni vaccini, dopo il terzo richiamo.

Test anticorpale: Laboklin dispone di un test anticorpale (virusneutralizzazione) che viene regolarmente effettuato nei piccoli animali per l’espatrio È possibile utilizzarlo per una titolazione post vaccinale anche per il cavallo.

West Nile Disease

E’ una patologia di tipo influenzale cui può seguire una grave encefalite, causata da un virus del genere Flavivirus, trasmissibile al cavallo, uomo, altri mammiferi da insetti ematofagi, con un ciclo che coinvolge anche alcuni uccelli migratori. Il cavallo è un fondo cieco per il virus in quanto la viremia non raggiunge i distretti periferici e la reinfezione ematogena delle zanzare che dovessero pungere un cavallo malato non appare possibile.

L’incubazione dura dai 2 ai 6 giorni. Segue la viremia, che corrisponde al picco febbrile, seguita a sua volta dai sintomi neurologici (atassia, depressione del sensorio, cecità, paralisi del posteriore, decubito, …) e da coma e morte nel 25% dei casi. Alcuni animali, dopo la viremia, presentano una remissione dei sintomi e guariscono, con successivo sviluppo di anticorpi (IgM entro i primi 20 giorni, IgG dopo almeno un mese). Da alcuni anni sono disponibili dei vaccini ricombinanti, chimerici od inattivati, protettivi per entrambi i ceppi virali (lineage 1 e lineage 2) circolanti in Europa.

1. somministrazione: dopo il 6° mese di vita, in aprile/maggio, per avere massima copertura nei mesi estivi
2. somministrazione: dopo 4 – 6 settimane.

Titolo anticorpale: permane per circa 6 mesi dopo il completamento delle vaccinazioni di base, dopo il sesto mese comincia a calare anche se la protezione dura per almeno un anno.

Test anticorpale: possiamo effettuare un test sierologico (Reverse ELISA) che permette di quantizzare sia le IgM, che indicano un’infezione recente in atto (e che quindi permettono al clinico di segnalare la presenza di un focolaio di malattia all’autorità sanitaria competente per territorio) che le IgG, che possono indicare sia un’infezione pregressa che una copertura immunologica di origine vaccinale.

Herpesvirus equini

Si tratta di un gruppo di virus che possono dare forme respiratorie altamente contagiose, aborto e forme neurologiche con turbe della deambulazione, paralisi del treno posteriore, disturbi della minzione. Sebbene non vi sia una netta separazione clinico-sintomatologica tra i vari ceppi erpetici, possiamo definire a grandi linee il quadro sintomatologico prevalente per ogni sierovariante:

• EHV1: aborto e forma neurologica
• EHV2: forme respiratorie lievi, congiuntivite
• EHV4: forma respiratoria e sporadicamente neurologica
• EHV5: forma polmonare (polmonite interstiziale).

Sia la copertura anticorpale vaccinale che quella prodotta dopo superamento della malattia durano 6–12 mesi al massimo; la profilassi vaccinale appare parzialmente protettiva per l’aborto e la forma respiratoria ma non protettiva per la forma neurologica.

Protocollo: i vaccini disponibili in Italia comprendono i ceppi EHV1 ed EHV4 (ceppo Kentucky). Si tratta di vaccini attenuati.

1. somministrazione: intorno al 5° mese di vita del puledro
2. somministrazione: dopo 4–6 settimane.
3. somministrazione: dopo altri 6 mesi.

Cavalle gravide: si consigliano tre richiami, al 5°-7°-9° mese di gestazione, al fine di raggiungere la massima copertura anticorpale tra il 10° mese ed il parto, periodo maggiormente a rischio per l’aborto o la natimortalità. Questo protocollo permette inoltre la produzione di anticorpi colostrali di pronta disponibilità per il puledro neonato, particolarmente esposto alla forma respiratoria, soprattutto negli allevamenti dove durante i parti si accumulano un gran numero di soggetti in poco tempo.

Titolo anticorpale: permane per circa 6 mesi dopo il completamento del ciclo di vaccinazioni di base, per questo motivo si consiglia di ripetere il vaccino semestralmente o comunque ad ogni gravidanza nelle fattrici.

Test anticorpale: Laboklin dispone di test anticorpali per tutte cinque le varianti erpetiche (IFAT), la diagnosi sierologica è attendibile solo dopo valutazione di una idonea sieroconversione, al fine di dimostrare il deciso incremento degli anticorpi nella fase acuta della malattia, che di solito coincide con la forma respiratoria (viremia). Nelle forme abortive, che possono seguire la fase respiratoria a distanza variabile, potremmo non avere un deciso picco anticorpale poiché il siero prelevato al momento dell’aborto non indica la fase acuta ma piuttosto una fase di convalescenza.

Dott.ssa Susanna Mereghetti