Principi generali

I virus sono microrganismi essenziali composti da materiale nucleare protetto da un capside proteico ed in alcuni casi da un rivestimento lipidico (envelope). Per vivere e riprodursi hanno bisogno di infettare delle cellule, dei batteri, delle piante e persino altri virus. A causa della loro natura microscopica non sono visibili se non al microscopio elettronico e possono essere pertanto trasportati da insetti cosiddetti vettori, per aerosol dopo tosse e starnuti, tramite contatto diretto di cute e mucose o scambi di fluidi corporei.

Vari materiali possono quindi essere inviati al laboratorio per la diagnostica virologica: tessuti, escreti, secreti, feci, sangue, fluidi corporei. Si possono utilizzare degli appositi tamponi senza medium od immettere i tessuti in soluzione fisiologica, i fluidi in provette sterili, le feci negli appositi contenitori, il sangue in EDTA / LiH.

I prelievi in vivo per la ricerca virale devono essere preferibilmente effettuati nella fase acuta febbrile della malattia, mentre per la diagnostica sierologica si considera la sieroconversione con doppio prelievo dopo circa 14 giorni dal primo, evitando la somministrazione concomitante di corticosteroidi. Per questi esami di ricerca anticorpale sono utilizzabili sia il siero che il plasma.

Diagnostica diretta: ricerca virale

Si basa sulla rilevazione della presenza del virus nel materiale raccolto e si avvale delle seguenti tecniche.

Ricerca di particelle virali (microscopia ed immunomicroscopia elettronica) utilizzata generalmente per quelle specie virali che crescono poco in coltura, con alcuni svantaggi:

• elevata concentrazione necessaria
• operatore dipendente
• tempistica lunga per la preparazione dei campioni e analisi.

Per questo motivo è una procedura poco utilizzata nei laboratori diagnostici, preferita invece nella ricerca.

Isolamento virale (coltivazione su tessuto colture) con valutazione degli eventuali effetti citopatici sul tessuto stesso. Le colture cellulari normali si presentano come un sottile velo compatto aderente alla parete della piastra, con uno strato che viene scomposto dalla replicazione del virus inoculato, che provoca necrosi cellulare diffusa (formando sincizi, corpi di inclusione, placche).

Purtroppo anche per questa metodica abbiamo dei limiti:

• lentezza ed effetto citopatico non chiaro per tutti i virus
• le colture cellulari sono molto virus-specifiche, quindi devo avere un chiaro sospetto presemina
• devono esserci virus vitali nel campione da testare.

Ricerca di antigeni virus-specifici (ELISA, EIA, IF diretta / indiretta): queste metodiche vengono usualmente utilizzate per la rilevazione del titolo anticorpale, ma possono essere impiegate nella ricerca delle parti proteiche del capside (che funge da antigene) evidenziando la presenza di complessi Ag-Ac attraverso una fluorescenza, o una colorazione. I vantaggi principali sono dati dalla estremarapidità e specificità.

Ricerca di acidi nucleici virali (metodica PCR) : è una metodica che permette l’amplificazione di parti di RNA o DNA virale eventualmente presenti nel materiale inviato in modo veloce e sicuro.

Diagnostica indiretta (sierologia)

Si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei pazienti la presenza di anticorpi contro alcuni specifici antigeni virali.

Nel corso dell’infezione vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali:

• IgM: si manifestano precocemente (generalmente entro il primo mese) e sono caratterizzate da estrema rapidità di sintesi ed azione ma scompaiono dopo alcune settimane, quindi non forniscono una protezione di lunga durata.
• IgG: si presentano più tardivamente ma sono più efficaci e persistono per anni, quindi si attivano a seguito di possibili ulteriori contatti con l’antigene per lungo tempo. Sono le stesse che vengono prodotte dalla somministrazione del vaccino e non sono distinguibili da quelle originate dall’infezione diretta.
• IgA secretorie mucosali: svolgono un importante ruolo di protezione delle mucose alla penetrazione virale, non sono usualmente ricercate per i test ematologici.

La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla ricerca di IgM (indice di infezione recente in soggetto sintomatico) o alternativamente valutando la cosiddetta “sieroconversione”, ovvero il deciso aumento del titolo anticorpale delle IgG del soggetto preso in esame, indice di infezione con viremia in atto.

Di solito servono 2 campioni: uno prelevato in fase acuta e l’altro in fase di convalescenza, possibilmente evitando la somministrazione di corticosteroidi. A volte però, la situazione e il decorso clinico della patologia non permettono questo tipo di indagine e un solo prelievo (il cosiddetto “siero tardivo”) con un alto titolo – indicato dal laboratorio come superiore alla soglia che indica il contatto recente con il virus in assenza di vaccinazione pregressa – permette una diagnosi presuntiva.

Il limite della diagnosi sierologica sta nella reattività crociata tra virus appartenenti alla stessa famiglia (sierotipi) e nella somministrazione di eventuali trattamenti immunomodulanti.

Vediamo le varie tecniche.

• Sieroneutralizzazione: permette la misurazione di anticorpi specifici che immessi in una coltura incubata con un determinato virus, neutralizzano a varie diluizioni un caratteristico effetto citopatico dello stesso. In pratica, il siero in esame viene mescolato in diluizioni seriali con una quantità fissa di virus che funge da antigene, poi le miscele vengono incubate in una coltura e se ne valuta l’effetto citopatico:

se non si verifica alcun effetto citopatico, significa che il siero in esame ha presenza di anticorpi neutralizzanti l’effetto del virus

Il titolo è indicato dalla massima diluizione attiva, quella per cui non si osserva più l’effetto citopatico

• Inibizione dell’emoagglutinazione (IEA): si tratta della rilevazione di anticorpi specifici in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus. In pratica, si mettono in contatto varie diluizioni del siero da testare con alcuni pozzetti contenenti delle emazie in sospensione in quantità fissa, assieme a particelle virali emoagglutinanti.

Il titolo è indicato dalla massima diluizione attiva, quella per cui non si osserva l’effetto emoagglutinante del virus, dimostrato dalla mancata formazione di un dischetto scuro di emazie sul fondo dei pozzetti

• Fissazione del Complemento (FC): in presenza di anticorpi specifici nel siero preso in esame, si forma un immunocomplesso che lega il complemento, impedendo la lisi delle emazie incubate. Queste si agglutineranno sul fondo del pozzetti senza alcuna reazione litica appunto, che avviene invece normalmente quando il siero è negativo.
• ELISA / Radio Immuno Assay: si tratta di moderni metodi cosiddetti “immunoenzimatici” dove la sostanza da rilevare (un antigene od un anticorpo) viene intercettata da una sonda che viene successivamente coniugata con un marcatore colorimetrico od un radionuclide (iodio-125) nel caso della RIA.

La metodica ELISA può essere quantitativa in base all’analisi della densità ottica del viraggio colorimetrico, o qualitativa, con valori soglia stabiliti statisticamente dal laboratorio (per questo motivo esiti da diversi laboratori possono non essere confrontabili a causa delle differenze tra le varie metodiche).

Vediamo le diverse varianti.

ELISA diretta

Si utilizza di solito per rilevare un antigene:

• la soluzione dell’antigene da testare è inoculata in 96 pozzetti e viene fatta aderire alla plastica
• viene aggiunta una proteina neutra per coprire le parti di pozzetto rimaste libere dall’antigene
• viene aggiunto un anticorpo che si lega all’antigene con un enzima coniugato
• si aggiunge il substrato per l’enzima
• il substrato legato all’enzima cambia colore

L’entità e la velocità del viraggio del colore è un indice della concentrazione degli anticorpi / antigeni presenti nella soluzione da testare. Se non vi sono anticorpi, nella soluzione non si verifica alcun viraggio.

ELISA indiretta semplice

Si utilizza per la rilevazione di un antigene, al quale viene coniugato un primo anticorpo specifico a cui viene abbinato un secondo anticorpo coniugato con l’enzima che determina la reazione colorimetrica.

ELISA sandwich

Si rileva la presenza di anticorpi verso un determinato anticorpo che viene fissato alla plastica del pozzetto e viene coniugato tramite un apposito antigene, che funge da “attacco” per l’enzima colorimetrico (come il ripieno di un sandwich appunto).

Competitive ELISA

Questa metodica permette una quantizzazione dell’anticorpo ricercato. Infatti quest’ultimo è incubato con il suo antigene, formando dei complessi Ag-Ac che verranno successivamente immessi in pozzetti con un nuovo antigene fissato alla parete. In questo modo si legheranno solo gli anticorpi rimasti liberi, andati in competizione con il precedente antigene nella soluzione che ha formato i complessi Ag-Ac che invece verranno dilavati. Nei pozzetti verrà in seguito immesso un terzo anticorpo, specifico per il primo anticorpo, che porta con sé l’enzima che permette la reazione colorimetrica solo sugli anticorpi coniugati con l’antigene.

Questa procedura è possibile sia per la misurazione quantitativa di anticorpi che per gli antigeni.

Meno anticorpo/antigene abbiamo nella soluzione iniziale messa in incubazione, più anticorpo / antigene viene fissato ai pozzetti e più forte è la colorazione rilevata.

Reverse ELISA

Si tratta di una tecnica recente che permette di quantizzare gli anticorpi rimasti sospesi nella soluzione piuttosto che quelli adesi ai pozzetti:

• il campione da testare è incubato con il suo antigene in quantità fissa
• il campione è poi passato in un tubo di flusso alle cui pareti è adeso lo stesso antigene
• quindi nella soluzione avremo degli anticorpi legati ad un antigene solubile e altri anticorpi legati ad un antigene simile della parete del tubo
• il campione con gli anticorpi legati in soluzione e alla parete vien fatto passare in un detector
• è possibile in questo modo la misurazione di IgG ed IgM contestualmente su uno stesso campione.

Il risultato viene espresso con un valore in percentuale inverso, ovvero: una più alta percentuale espressa corrisponde ad un titolo anticorpale più basso, in quanto la percentuale di anticorpi legati alla parete del tubo risulta maggiore.

In Laboklin questo tipo di test viene utilizzato per la diagnostica anticorpale del virus della West Nile disease, con misurazione contemporanea di IgG ed IgM, fondamentale per una corretta diagnosi di malattia in atto.

WESTERN BLOT

Con questo test possiamo separare una miscela di proteine (tessuti o colture cellulari) e identificare successivamente la presenza di anticorpi.

In pratica la miscela da analizzare viene prima separata con un’elettroforesi su gel, incubata con un anticorpo primario che rileva l’antigene e di seguito miscelata con un secondo anticorpo collegato ad un enzima che catalizza una reazione colorimetrica / chemoluminescente / radiografica o fluorescente la cui intensità è una misura quantitativa della presenza di anticorpi.

Immunodiffusione in gel di agar (AGID)

È in pratica una reazione di precipitazione tra un antigene posto al centro della piastra e alcuni sieri da analizzare posti in vicinanza dell’antigene, inglobati in un gel di agar:

dove i sieri sono positivi, si formano degli immunocomplessi che sono insolubili e precipitano formando una striscia detta “linea di identità”, che dimostra visivamente la positività al test.

Si tratta del test ufficiale e specifico per la diagnosi di Anemia Infettiva nel cavallo (AIE) in quanto la reattività antigenica si esplica contro la proteina p26, una proteina maggiore molto specifica del capside caratteristica di questo Lentivirus.

Le altre metodiche utilizzate (ELISA) possono reagire anche nei confronti di altre proteine di membrana, meno specifiche, e sono pertanto possibili reazioni crociate. Sono più rapide ma, in caso di positività, la conferma per l’attuazione delle disposizioni di Polizia Veterinaria previste in questo caso, viene attivata solo dopo conferma di positività da AGID presso gli Istituti Zooprofilattici di competenza territoriale.

Apparato locomotore

Liquido sinoviale

È possibile eseguire la coltura del liquido sinoviale da tampone al momento del prelievo, da provetta tappo rosso e da bottiglia da emocoltura, se l’aspetto di questo materiale non indica la presenza di eritrociti, pus e fibrina.

E’ possibile inoltre allestire un esame citologico diretto dopo citospin oppure immettendo la sinovia in una provetta con EDTA, permettendo ai tecnici del laboratorio di allestire un citologico anche dopo 24/48 ore dal drenaggio articolare. Una coltura positiva è altamente probabile se ci si trova di fronte ai seguenti parametri:

• proteine totali > 4 gr/dl
• WBC > 30.00 con neutrofili > 80%
• pH < 6,9
• lattati > 4
• glucosio < 80
• siero amiloide (SAA) elevata sia nella sinovia che nel sangue.

Studi recenti (Hines, 2020) mostrano come il monitoraggio della SAA sierica possa contribuire a differenziare le artriti settiche da quelle traumatiche e dall’artrosi, nonché valutare la risposta alle terapie antibiotiche (la SAA varia molto rapidamente permettendo di modulare le terapie quasi in tempo reale).

Questo parametro non si innalza dopo artrocentesi o lavaggi ripetuti, ma solo in presenza di infezioni batteriche non controllate. Se la fonte dell’infezione non è a livello articolare ma in altri distretti del corpo, la SAA sistemica risulterà più alta rispetto a quella sinoviale, viceversa se è proprio l’articolazione il distretto affetto da sepsi.

Bisogna considerare che le colture allestite da liquidi che normalmente dovrebbero essere sterili, possono richiedere più tempo per la crescita di microrganismi eventualmente presenti – soprattutto se non si utilizza la bottiglia di emocoltura per la loro raccolta. È quindi opportuno considerare anche altri parametri che possano aiutare a prendere decisioni terapeutiche veloci. In questi casi il tempismo è infatti molto importante, soprattutto per i puledri per i quali un ritardo terapeutico potrebbe compromettere gravemente lo sviluppo delle cartilagini articolari, con prognosi sfavorevole per l’attività sportiva.

Possibili patogeni: per questo distretto rileviamo Enterobacter, Streptococcus e Staphyilococcus. Se al momento del prelievo sono stati già somministrati antibiotici di copertura, l’utilizzo di bottiglie da emocoltura permette di affinare e velocizzare la crescita di microrganismi. Per alcuni parassiti come Borrelia possiamo allestire una ricerca tramite PCR su questo materiale.

Tessuto muscolare

In caso di ferite o lesioni purulente di questo distretto, è sempre preferibile effettuare dei tamponi dai tessuti profondi e/o in abbinamento ad un esame istologico delle zone coinvolte, in quanto i batteri isolati in superficie potrebbero essere confusi con i normali contaminanti cutanei. Infezioni gravi in localizzazioni muscolari profonde potrebbero anche derivare da germi giunti da altri distretti per via ematogena, rilevabili pertanto tramite emocoltura.

Possibili patogeni:

• Escherichia coli,
• Staphylococcus,
• Streptococcus,
• Corynebacterium,
• Clostridium e Fusobacterium.

Apparato nervoso

Liquido cefalorachidiano

Sebbene si tratti di un fluido molto delicato e normalmente sterile, anche per questo materiale abbiamo la possibilità di effettuare un esame batteriologico. La scelta migliore è quella di immetterlo in una bottiglia da emocoltura, eseguire su questo un tampone con medium e immettere il liquido in una provetta sterile sono comunque opzioni possibili.

Di solito ad una coltura positiva corrisponde un liquor visivamente alterato (emorragico o giallastro) con un deciso aumento delle proteine totali e della cellularità, per la presenza di cellule della serie bianca o pigmenti originati dalla migrazione e degenerazione degli eritrociti per vasculopatia concomitante (xanthochromia).

Neutrofili o linfociti potrebbero essere presenti anche in caso di infezioni virali, necrosi o malattie immunomediate: per questo è preferibile completare l’esame batteriologico con una citologia da citospin per avere un quadro più chiaro della patologia, immettendo parte del liquido in provetta con EDTA.

Si ricorda che è inoltre possibile prelevare il liquido cefalorachidiano nell’animale in vita dalle ultime vertebre lombari (L6-S1) con una blanda sedazione, oltre che dalla giunzione atlanto-occipitale in anestesia generale o nell’animale in decubito.

Possibili patogeni: batteri come Corynebacterium, Listeria, Staphylococcus e Streptococcus, Klebsiella, Pasteurella, Proteus, ma anche miceti come Aspergillus (dalle tasche gutturali) o Cryptococcus. In questi casi il fluido potrebbe presentarsi viscoso o torbido per la presenza di ife.

Ricordiamo che con sospetto di aspergillosi possiamo effettuare una PCR per rilevazione del DNA del micete senza aspettare la crescita in coltura, come pure in caso di alcuni parassiti come Borrelia, e molti agenti virali neuropatogeni (Herpesvirus, West Nile virus, Bornavirus, e altri).

Alcuni agenti batterici di malattie neurologiche non hanno localizzazione nel sistema nervoso centrale: Clostridium tetani e botulinum si trovano infatti raramente in pazienti malati, perché la loro azione si esplica principalmente attraverso la presenza di tossine, quindi un esame batteriologico non è indicato in questi casi.

Apparato tegumentario

Cute e linfonodi

L’esame batteriologico della cute e dei linfonodi andrebbe sempre abbinato ad una biopsia e/o citologia cutanea, in quanto molti batteri sono presenti in questo distretto come normale flora non patogena. In ogni caso si raccomanda una pulizia e disinfezione accurata della parte prima dell’esecuzione del tampone, in modo da eliminare i commensali. La differenziazione è possibile anche sulla base della tipologia (purezza e rapidità) di crescita delle colonie batteriche isolate. In caso di ascessi di linfonodi esplorabili si consiglia di andare a toccare con un tampone la parete dell’ascesso piuttosto che raccogliere semplicemente il pus che fuoriesce all’esterno, che potrebbe contenere solamente corpi batterici di microrganismi morti.

Vediamo quali patologie possono interessare questo distretto.

Dermatofitosi

I miceti che possono determinare infezioni micotiche cutanee frequenti nel cavallo sono Trichophyton e Microsporium. Per allestire una coltura micotica sono indicate la raccolta di croste, peli e cute oppure un tampone dai bordi della lesione: se molto sporca è possibile pulire la zona con alcool prima dell’esecuzione del tampone stesso.

Dermatofilosi

L’agente eziologico Dermatophilus congolensis richiede terreni di coltura particolari e l’eventuale sospetto diagnostico, formulato sulla base dell’aspetto delle lesioni riscontrate, deve essere segnalato al laboratorio al momento dell’invio dei campioni (tamponi, croste o cute).

Cellulite

Si tratta di un’infezione del sottocute di solito associata a Staphylococcus, Clostridium, Corynebacterium, Actinobacillus, ma anche Actinomyces, Histoplasma e Sporotrix potrebbero essere coinvolti come agenti di micosi profonde. Ricordiamo come agenti eziologici non comuni di patologie cutanee profonde per il puledro Rhodococcus e Corynebacterium.

L’esecuzione di un esame batteriologico completo di antibiogramma permette di agire in modo tempestivo e con antibiotici da subito efficaci, trattandosi di infezioni di complicata gestione e che richiedono generalmente lunghe terapie.

Occhio

Effettuare tamponi oculari richiede particolare attenzione. Si consiglia pertanto un’idonea sedazione del paziente abbinata ad anestesia locale soprattutto per prelievi corneali, per evitare di toccare palpebre od annessi, che potrebbero far riscontrare popolazioni batteriche miste. In caso di ulcere corneali si consiglia di effettuare un tampone dai bordi delle medesime. È possibile l’esecuzione di un esame citologico tramite impressione di uno o più vetrini lasciati poi asciugare all’aria ed inviati al laboratorio contestualmente al tampone, senza colorazione.

Possibili patogeni: la presenza di Aspergillus od altri agenti micotici è frequente in caso di infezioni ricorrenti.

Emocolture

Questo tipo di esame necessita di apposite bottiglie da coltura per aerobi ed anaerobi, che Laboklin fornisce su richiesta. In questi contenitori sono presenti un brodo di coltura idoneo ed alcune resine e sostanze che agiscono inattivando i fattori autolitici e alcuni antibiotici eventualmente presenti nel sangue al momento del prelievo, agevolando invece la crescita di microrganismi.

Quando possibile, si consiglia di effettuare almeno 2–3 prelievi da differenti siti venosi nell’arco delle 12 ore (una positività riscontrata in più di un prelievo permette una maggior precisione diagnostica) seguendo queste procedure:

• utilizzare guanti sterili o disinfettati con clorexidina al 2%
• contenere l’animale per evitare di dover pungere più volte la cute
• tosare, pulire con alcool e disinfettare molto bene il sito di prelievo con clorexidina 2% o tintura di iodio, lasciando asciugare il disinfettante per evitare la sospensione dei microrganismi cutanei che potrebbero in questo modo penetrare più facilmente
• pungere centralmente la vena tenendo la punta dell’ago molto vicina alla cute (il buco visibile all’esterno)
• prelevare il giusto quantitativo di sangue (8 – 10 ml) senza interruzioni
• disinfettare il cappuccio delle bottiglie e cambiare l’ago: non deve essere il medesimo usato per il prelievo
• inoculare il sangue nelle bottiglie (prima nel flacone per gli anaerobi poi in quello per gli aerobi in quanto potrebbe risalire dell’aria nell’ago con la prima inoculazione)
• capovolgere lentamente le bottiglie un paio di volte per mescolarne il contenuto
• spedire prontamente il materiale a temperatura ambiente.

Possibili patogeni: nei puledri si riscontrano facilmente batteri gram negativi di origine enterica:

• Enterococcus,
• Escherichia coli,
• Actinobacillus,
• Staphylococcus,

nell’adulto possiamo rilevare anche batteri di origine polmonare o da metriti nella fattrice.

I test batteriologici e micologici sono un ausilio molto importante nella clinica equina di campo. Vediamo alcuni suggerimenti che permettono di ottimizzare l’efficienza di questo tipo di diagnostica per i vari distretti.

Considerazioni preanalitiche

La cosa migliore da fare quando si richiede un esame batteriologico che riguardi un tessuto, un organo o delle secrezioni, sarebbe di inviare al laboratorio il materiale in toto da seminare. Purtroppo questo non sempre è possibile per ovvie problematiche logistiche (corriere, attività itinerante del veterinario che si occupa di equini, materiali deperibili, …) e quindi una buona opzione è quella di utilizzare un tampone con terreno di trasporto, in modo da “fotografare” la situazione batteriologica/micologica del campione al momento del prelievo.

Laboklin fornisce gratuitamente dei tamponi con medium di Amies con carbone, che permette un buon isolamento di molti funghi e batteri aerobi ed anaerobi, responsabili di patologia in veterinaria e anche particolarmente delicati (es. Taylorella equigenitalis per le fattrici). Non si tratta di un terreno nutritivo ma solamente preservante, che inibisce le reazioni cellulari degenerative ed ossidative, fotografando per quanto possibile la popolazione dei microrganismi presente al momento del prelievo per almeno 24/48 ore, sia per batteri che per miceti. A richiesta forniamo anche tamponi con terreno Stuart senza carbone, anch’esso adatto alla maggior parte degli apparati. I tamponi senza terreno di trasporto sono invece utili per l’esecuzione di esami genetici o di PCR per la ricerca di diversi agenti patogeni.

Una volta prelevato il materiale da sottoporre a coltura, si consiglia di spedirlo entro le 24 ore. Non è necessario mantenerlo refrigerato, quando arriverà in laboratorio verrà infatti immesso in un primo terreno di arricchimento in modo da poter avere una prima crescita nelle successive 24/48 ore ed un secondo isolamento entro i 3 giorni.

Laboklin fornisce a richiesta anche delle apposite bottiglie per emocoltura che non necessitano di trasporto particolare, utilizzabili anche per l’esame batteriologico di alcuni liquidi cavitari particolarmente delicati.

Per la coltura micotica valgono le stesse indicazioni della batteriologia. Inoltre, dato che la crescita fungina è generalmente più lenta, per alcuni microrganismi possiamo effettuare una ricerca tramite metodica PCR che permette di identificare l’agente eziologico in 2/4 giorni anziché aspettare lo sviluppo della colonia. Si possono utilizzare tamponi con medium, sperma per la Taylorella equigenitalis o parti di cute, croste e peli per i dermatofiti.

Antibiogramma 

Si tratta di un metodica sviluppata per stabilire se il microrganismo isolato in coltura è sensibile agli antibiotici (o antimicotici) che possono venir utilizzati nel cavallo. Esistono due metodiche utilizzabili a questo scopo, vediamo quali sono.

Metodo per diffusione (Kirby – Bauer): si applicano sulla superficie della coltura isolata dei dischetti di carta impregnati con una quantità fissa dei vari antibiotici che intendo testare, i quali diffonderanno concentricamente nell’agar della piastra di coltura, causando un alone di inibizione della crescita. Misurando dopo 24 ore questa zona di inibizione della crescita attorno ad ogni dischetto di antibiotico, sarà possibile catalogare il microrganismo come sensibile (S), resistente (R) o intermedio (I) per ogni antibiotico presente sul disco, in funzione proprio dell’ampiezza della zona di inibizione (maggiore è l’ampiezza, più è efficace la molecola). I diametri rappresentano l’espressione dell’inibizione della crescita rapportata alla diffusione di una quantità fissa di antibiotico nel gel e non permettono di quantizzare la minima concentrazione efficace (MIC) di antibiotico che potrebbe essere sufficiente ad ottenere l’effetto terapeutico desiderato.

Microdiluizione in brodo: si tratta del metodo che utilizziamo di routine e che costituisce il gold standard per la valutazione dell’efficacia di un antibiotico, in quanto fornisce risultati quantitativi. La coltura isolata viene infatti inoculata in pozzetti contenenti diluizioni seriali degli antibiotici da testare (16–8–4 -2–1-0,5–0,25-0,12 mg/L), incubata a 37° per 20 ore, dopodiché viene letta la più bassa concentrazione di antibiotico (MIC) che risulta inibire in modo visivamente chiaro la crescita delle colonie presenti nel brodo e questo costituisce il cosiddetto “endpoint”.

I valori soglia per stabilire la sensibilità o resistenza del microrganismo presente in coltura sono di solito quantizzati con un numero variabile, specifico per ogni coppia “microrganismo vs antibiotico testato” e vengono stabiliti da Comitati Internazionali, considerando la possibilità di ottenere facilmente quel livello terapeutico plasmatico di farmaco in vivo, senza incorrere in fenomeni di tossicità; lo stesso valore numerico potrebbe quindi essere abbinato ad una definizione di “resistente” per una molecola poco diffusibile nei tessuti, oppure “sensibile” per un’altra, qualora le corrispondenti concentrazioni plasmatiche fossero ottenibili con facilità nel cavallo.

In pratica vengono stabiliti due valori soglia (i cosiddetti “breakpoints” bkp1 e bkp2) all’interno dei quali si è stabilito, attraverso prove cliniche (microbiologiche e farmacologiche), il range ottimale di efficacia di quella molecola per il cavallo, e si confronta il cosiddetto “endpoint” della molecola testata in vitro con questi due valori di riferimento: a seconda di dove si posiziona l’endpoint relativo alla MIC del dato antibiotico, il microrganismo viene classificato come:

• sensibile se inferiore a bkp1
• intermedio se all’interno di bkp1 e bkp2
• resistente se superiore a bkp2

Il clinico poi con queste informazioni può valutare quale antibiotico utilizzare e con quale dosaggio per avere la maggior probabilità di successo terapeutico, riducendo l’insorgenza di fenomeni di antibioticoresistenza.

Vediamo ora i principali impieghi della batteriologia / micologia per singolo apparato nel cavallo.

Apparato urogenitale

Tamponi uterini: abbiamo a disposizione dei pacchetti particolarmente convenienti di “Idoneità alla riproduzione” (esame batteriologico, CEM e micologico) appositamente studiati per investigare l’endometrio; possono essere richiesti su tamponi diretti, su tampone da biopsia o da low volume flush. La crescita batterica riscontrata sarà sottoposta ad antibiogramma qualora ritenuta patogena per quel distretto o presente in alta carica. Nel referto verrà specificato se la fattrice può venire coperta o necessita di un trattamento.

Per una maggior accuratezza è sempre consigliabile abbinare alla batteriologia i reperti clinici, l’anamnesi ed un esame citologico (da citobrush o low volume flush) per poter prendere le corrette decisioni terapeutiche.

Tamponi per CEM (Taylorella equigenitalis): si tratta di un agente patogeno venereo piuttosto contagioso. Questi tipo di accertamenti vengono solitamente effettuati in sede di compravendita o prima di una monta naturale, sia nella fattrice che nello stallone.

Possiamo allestire sia una coltura contestualmente ad un normale esame batteriologico, sia solo per Taylorella, o ancora effettuare una PCR su tampone con medium, quest’ultima metodica con tempistiche particolarmente favorevoli. A questo proposito ricordo che offriamo un “Profilo CEM – PCR per lo stallone (3 localizzazioni: prepuzio, uretra e fossa del glande) e per la fattrice (2 localizzazioni: fossa e seni clitoridei)” che permettono di avere un esito in 1– 3 giorni.

Una crescita batterica in bassa carica senza ulteriori indizi (citologici, clinici od ecografici) di infezione in atto, non permette una diagnosi di endometrite.

Possibili patogeni endometriali includono: Streptococcus zooepidemicus, Klebsiella sp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter. La presenza di miceti come Candida sp. / Aspergillus sp. è sempre un indizio di alterazioni anatomo-funzionali gravi dell’apparato riproduttore.

Per la terapia sono utilizzabili sia antibiotici / antimicotici per infusione uterina che per via sistemica e la scelta si effettua tenendo conto dei risultati dell’antibiogramma, della fase del ciclo estrale e delle tempistiche di inseminazione.

Urina: è sempre preferibile recuperare il materiale tramite cateterismo, sia nella fattrice che nello stallone, anche se è descritta la presa delle urine “al volo”, che può essere però difficoltosa in alcuni soggetti. La cistocentesi è metodica attuabile solamente nel puledro neonato o molto piccolo, per ovvi limiti dimensionali.
Le urine possono anche essere sottoposte a coltura direttamente, se prelevate e spedite rapidamente e quindi seminate entro le 24 ore dalla raccolta. In alternativa è preferibile effettuare subito un tampone con medium sul materiale raccolto per poi inviarlo contestualmente al resto del liquido prelevato per ulteriori approfondimenti. Laboklin fornisce gratuitamente i contenitori adatti per la raccolta di urina, con tutte le accortezze e protezioni necessarie per una spedizione in sicurezza.

Specificando sempre un’accurata anamnesi, la sintomatologia clinica e la metodica di raccolta del campione, i nostri batteriologi potranno valutare se una eventuale crescita batterica – dato che le urine non sono sterili – sia da considerarsi patologica o meno, e quindi allestiranno un antibiogramma se il tipo di microrganismo o la carica riscontrata faranno pensare ad una infezione in corso, in modo da aiutare il clinico nel prendere le decisioni terapeutiche più opportune.

Possibili patogeni isolabili includono:
Streptococcus zooepidemicus, Klebsiella sp., Escherichia coli, Corynebacterium sp.. Per la terapia (dopo antibiogramma) sono da preferire gli antibiotici che vengono escreti per via urinaria.

Apparato respiratorio

Vie respiratorie superiori: i tamponi da scolo nasale sono generalmente poco specifici per la diagnostica batteriologica delle forme respiratorie di questo distretto. Per le patologie dei seni, delle tasche gutturali e della faringe si consiglia il prelievo tramite endoscopio. È possibile anche effettuare un tampone dell’ostio delle tasche od un tampone faringeo “alla cieca” utilizzando i normali tamponi uterini, ovviamente scamiciati. La metodica non è complicata e non richiede sedazione, permette di ottenere campioni particolarmente diagnostici con meno contaminanti. Ovviamente vanno posti in apposito medium per il trasporto al laboratorio.

Tracheal wash e BAL: il fluido raccolto con queste metodiche può essere inviato al laboratorio in provetta da siero per la batteriologia e in provetta EDTA per la citologia, oppure possiamo effettuare un tampone con medium direttamente al momento del prelievo, ricordando di eliminare il fluido che appare molto schiumoso per la presenza di surfattante.

L’esame batteriologico da TW permette di evitare la contaminazione batterica di microrganismi presenti in orofaringe (a meno di ripetuti accessi di tosse), mentre la batteriologia da BAL è generalmente meno attendibile poiché è possibile che si verifichino delle contaminazioni al momento della introduzione del catetere / endoscopio per via naso-faringea.

Le vie aeree del cavallo non sono sterili ed alcuni batteri potenzialmente patogeni potrebbero essere isolati anche in animali sani. La discriminante terapeutica quindi è sia la quantizzazione delle colonie ma soprattutto la citologia ed i reperti clinici.

Possibili patogeni respiratori includono: Streptococcus zooepidemicus, Actinobacillus, Klebsiella sp., Escherichia coli, Rhodococcus nel puledro.

Per la terapia (dopo opportuno antibiogramma) sono da preferire gli antibiotici che diffondono bene nel parenchima polmonare e negli eventuali ascessi presenti.

Liquido pleuro-pericardico: questi fluidi devono essere raccolti con metodica ecoguidata. È possibile poi:

• immetterli in bottiglie da emocoltura, se l’aspetto macroscopico non è troppo alterato
• raccoglierli in provette da siero (per test biochimici e batteriologia)
• effettuare un tampone diretto al momento del prelievo
• utilizzare provette con EDTA per la citologia.

È da segnalare che di solito il liquido pleuropericardico con batteriologia positiva appare molto alterato già ad una rapida ispezione visiva. In attesa della coltura è pertanto consigliato ricercare all’esame citologico la presenza di corpi batterici che, dopo le opportune colorazioni (gram positivo vs gram negativo), possono già indirizzare il clinico verso la scelta dell’antibiotico più adatto.
Per la terapia di questo distretto si consigliano lavaggi e drenaggi ripetuti, con soluzione salina addizionata ad antibiotico secondo i test di sensibilità, in quanto la penetrazione degli antimicrobici per via sistemica in questo distretto non è ottimale.

Apparato gastro-enterico

Peritonite: in caso di sospetta peritonite settica è possibile prelevare del liquido peritoneale tramite centesi senza ulteriori rischi, possiamo poi come per gli altri liquidi cavitari effettuare:

• un tampone sul fluido raccolto
• immettere il materiale in una provetta sterile da siero (per gli esami biochimici e la batteriologia)
• utilizzare una provetta con EDTA qualora si voglia effettuare un esame citologico.

La bottiglia da emocoltura è utilizzabile solo se nel fluido non si rileva sangue, fibrina, pus, feci o materiale alimentare.

In caso di peritonite settica acuta possono non esserci i tempi tecnici per aspettare una coltura, vale quindi quanto affermato per il liquido pleuropericardico: ricercare i corpi batterici tramite un esame citologico – generalmente dopo citospin – per stabilire a grandi linee che tipo di terapia antibiotica preferire (gram positivi / gram negativi) in attesa dei più precisi risultati colturali.

Se la peritonite settica è risultato di una rottura viscerale od una pregressa chirurgia addominale potremmo avere isolamento di più di una popolazione batterica. L’isolamento di un solo agente patogeno è maggiormente frequente nel puledro (Rhodococcus equi, Streptococcus equi, …).

Enterocoliti: in questi casi possiamo effettuare un esame batteriologico fecale, offriamo infatti un “Profilo feci / diarrea” per adulto e uno per puledro, con batteriologia e micologia per ricerca di agenti patogeni come Salmonella e Clostridi e per la rilevazione di enterotossine, oltre ad un esame parassitologico e PCR per Giardia, Rhodococcus, Lawsonia (virus intestinali). Gli esiti sono normalmente disponibili in 1–3 giorni lavorativi.

Laboklin fornisce noi gratuitamente gli appositi contenitori ermetici protetti per un’idonea raccolta ed un trasporto sicuro di materiale fecale.

Particolarità del tratto digestivo del cavallo

Il tratto digestivo del cavallo è strutturato per l’utilizzazione ottimale dei derivati vegetali. La digestione inizia già nella bocca con la macinazione dell’alimento e la sua miscelazione con la saliva. La presenza di una dentatura in salute è prerequisito indispensabile affinché ciò avvenga. I cavalli sono predisposti all’ostruzione esofagea (choke) se hanno problemi dentari, mangiano troppo in fretta o si cibano di alimenti inadatti. Gli equini mangiano in continuazione, tuttavia il loro stomaco appare piuttosto piccolo se rapportato alla taglia dell’animale ed ha la capacità di soli 8–15 litri, il che significa che possono essere ingerite solo piccole quantità di cibo alla volta. Il pH corrisponde a 2 ed è molto acido, inoltre questo acido gastrico viene prodotto costantemente. Quando l’alimento è ingerito e mescolato con la polpa di barbabietola, il valore di pH si alza e si previene quindi l’iperacidità, cosa che riduce il rischio di ulcere gastriche. La digestione enzimatica e l’assorbimento dei nutrienti avviene invece nel piccolo intestino dove si verifica la scissione dei carboidrati, delle proteine e dei grassi.

Il grosso intestino comprende il cieco, il colon ed il retto. Nel cieco sono metabolizzate le fibre grossolane difficili da digerire, come la cellulosa e la pectina, che sono scisse in acidi grassi a catena corta, fonte di energia per l’animale, ad opera dei numerosi microrganismi (della flora batterica). La colonizzazione batterica è determinata dal tipo di cibo ingerito: se non è bilanciato infatti provoca delle fermentazioni anomale. Nel colon avviene la formazione delle vitamine idrosolubili del gruppo B ed anche la vitamina C, come pure l’assorbimento dei liquidi e degli elettroliti.

Segni clinici della presenza di disturbi digestivi

Nei cavalli ci sono molti sintomi generici di patologia gastrica. Includiamo, tra gli altri:

• diarrea
• costipazione, feci molto secche
• colica: dolore addominale che si manifesta con rampare, calciare verso i fianchi, agitare la coda, rotolarsi frequentemente, sudare, manifestazioni di irrequietezza, apatia
• perdita di appetito
• problemi a defecare
• eccesso di acidità gastrica
• calo delle performance e poca cavalcabilità
• flehmen, aumento degli sbadigli
• ostruzione esofagea, specialmente in cavalli anziani.

L’ippiatra che lavora in campo può trovarsi a dover gestire anche questo tipo di spiacevole diagnostica in soggetti deceduti sia improvvisamente che dopo un iter terapeutico che purtroppo non ha sortito l’effetto sperato.

Non sempre infatti risulta possibile per cause logistiche od economiche (trasporto, festivi….) l’affidamento della carcassa presso gli Istituti Zooprofilattici od Università. Effettuare in questi casi una necroscopia in campo e inviare i campioni patologici in laboratorio per l’istologia può costituire una valida alternativa.

Vediamo alcuni concetti di base:

• i fenomeni autolitici iniziano molto velocemente dopo il decesso, quindi bisogna agire velocemente
• un’attenta e dettagliata anamnesi aiuta molto i patologi
• sono necessari alcuni strumenti come sega e seghetto, tronchesini, coltelli affilati di varie misure, forbici e pinze
• si raccomanda l’utilizzo di camici monouso, guanti, mascherine e stivali di gomma
• servono speciali contenitori protetti con formalina al 5% per la raccolta di tessuti ed organi, tamponi con medium per la batteriologia, siringhe e provette sterili per la raccolta di fluidi vari con etichette chiare e pennarelli indelebili per la corretta identificazione di tutti i campioni
• la superficie dove si intende effettuare questi tipo di esame deve essere lavabile e ben illuminata.

Raccolta dei campioni: principi generali

Istologia: i campioni di tessuto vanno immessi negli appositi contenitori in formalina al 5% che vengono forniti gratuitamente dal laboratorio. È importante che il liquido fissativo penetri correttamente in tutte le parti anatomiche e per questo motivo dobbiamo tenere presente alcuni punti: le dimensioni massime dei pezzi istologici devono essere di 2 cm di diametro. In alternativa, per particolari organi (occhio, grossi noduli o linfonodi), è possibile eseguire dei tagli “a libro”, immergendo completamente per 2–3 gg la massa in formalina al 5%, poi – una volta fissati i tessuti – si spedisce il pezzo avvolto in garze imbevute di formalina in apposite buste di plastica sigillate.

Contattateci per avere maggiori informazioni su materiale e procedure di spedizione precise.

Batteriologia, micologia e PCR: il tessuto immesso in formalina non è utilizzabile per la batteriologia e per la maggior parte degli esami PCR per la ricerca di agenti eziologici, per questo motivo, per questi test suggeriamo:

• di immettere liquidi e tessuti in contenitori sterili (provette da siero), immergendo i pezzi patologici in soluzione fisiologica per evitare il deterioramento cellulare
• di effettuare un tampone con medium sia per i liquidi che per i tessuti al momento della raccolta per la batteriologia / micologia
• di immettere i liquidi cavitari destinati ad un esame citologico in provette con EDTA, per ostacolare l’agglomerazione cellulare permettendo l’allestimento di citospin diagnostici anche dopo le 24 ore.

Si raccomanda di identificare in modo chiaro e preciso l’origine dei vari materiali con pennarelli indelebili in quanto le alterazioni tissutali possono fuorviare i patologi nell’interpretazione delle lesioni se non sono sicuri di quale sia l’organo di partenza.

Esame esterno: è sempre utile esaminare la cute, le mucose, le sclere, e gli zoccoli del soggetto deceduto alla ricerca di alterazioni macroscopiche, per avere una visione globale della situazione.

Apertura della carcassa: è importante cercare di mantenere l’anatomia topografica degli organi interni al momento della morte, quindi è necessario essere meno demolitivi possibile con le procedure necroscopiche. Per convenzione, si pone l’animale sul lato destro, di modo da effettuare il taglio dal lato sinistro, con queste modalità:

• si inizia con un’incisione paracostale dalla fossa paralombare fino alla cartilagine xifoidea, scollando attentamente tutti gli strati di tessuto cercando di non danneggiare i visceri sottostanti
• si prosegue con un’incisione craniale che parta appena posteriormente al gomito dirigendosi dorsalmente fino alle scapole
• si riflette la parte muscolare cranialmente in modo da esteriorizzare la gabbia toracica e la cavità addominale con una visione d’insieme completa dei due distretti

Consideriamo ora i singoli apparati

Apparato cardiopolmonare: per l’esame della cavità toracica è necessario incidere il diaframma vicino allo sterno e scollarlo dalla parete. Questa manualità produce l’ingresso di aria ed il collasso dei polmoni.

A questo punto si tagliano le coste nei punti di attacco ventrale e dorsale e si solleva la gabbia toracica ribaltandola cranialmente. Questa manualità permette di prendere in esame il cuore, lo spazio mediastinico, le sierose, i linfonodi ed i vasi annessi, scollando se necessario l’arto anteriore dal gomito e riflettendolo anch’esso cranialmente. L’esame della cavità si completa con l’esteriorizzazione dell’esofago e della trachea tramite l’incisione della parte ventrale del collo, tagliando i due organi per la loro lunghezza e controllando la tiroide, le paratiroidi ed i linfonodi della zona.
Il cuore deve essere ispezionato ed il pericardio aperto. È possibile prelevare il liquido pericardico e sottoporlo ad esame batteriologico come pure asportare la sierosa ed eventuale materiale estraneo presente (sangue, pus, fibrina…).

Possiamo quindi asportare il cuore – tagliando i grossi vasi, da questo lato vedremo la vena cava, poi l’aorta con le due biforcazioni, infine i vasi polmonari – e valutare camere e valvole aprendo completamente questo organo in questo ordine:

• cuore destro: aprendo la vena cava si procede all’ispezione della tricuspide, poi si incide l’apice destro e si apre il ventricolo fino ad esaminare le valvole polmonari e l’arteria polmonare, visualizzando quindi completamente entrambe le camere destre
• cuore sinistro: si parte sezionando l’aorta per poi ispezionare la valvola aortica e successivamente la mitrale e le vene polmonari dopo aver inciso ed aperto l’apice sinistro.

Il polmone destro può essere esteriorizzato tirando verso l’alto la base dell’organo localizzata vicino al diaframma. Deve poi essere attentamente palpato ed esaminato con sezioni seriali partendo dall’area cardiaca per evidenziare la presenza di neoformazioni o piccoli ascessi interni. In questo modo si visualizzano le vie aeree inferiori ed i vasi polmonari, che vanno ispezionati aprendoli secondo la loro lunghezza con delle forbici.

Il polmone sinistro è visualizzabile solo rimuovendolo completamente dalla carcassa, tirando verso l’esterno trachea, esofago e polmone destro e ripetendo le medesime manualità ispettive.

Raccolta dei campioni: a parte ogni lesione patologica, per questo distretto possiamo anche recuperare sangue ventricolare o liquidi pleuro-pericardici di varia natura, eventuale materiale aspirato per la batteriologia e la ricerca di agenti eziologici (PCR e coltura).

Apparato gastroenterico: una volta aperto l’addome, è possibile estrarre ed appoggiare all’esterno il grosso colon, di modo da visualizzare i rimanenti organi in situ (piccolo intestino, stomaco, fegato, milza, linfonodi addominali) rendendo possibile il prelievo di tessuti patologici. In particolare:

• le viscere vanno aperte seguendo la loro lunghezza e lo stomaco lungo la grande curvatura; si esamina il contenuto gastrico ed enterico e dopo lavaggio accurato si valuta l’ aspetto della mucosa
• i linfonodi mesenterici vanno sezionati e le sierose esaminate attentamente
• fegato e milza vanno palpati ed il parenchima sezionato per controllare vasi e dotti.

Nei puledri neonati o in caso di feti abortiti, si consiglia di effettuare un tampone con medium del contenuto gastrico per rilevare una eventuale contaminazione batterica intrauterina o relativa al periparto (liquido amniotico o meconio ingeriti).

Apparato urogenitale: a questo punto possiamo valutare anche reni, vescica, utero ed ovaie o testicoli ed annessi. I reni andrebbero tagliati “a panino” dall’esterno verso la pelvi e la capsula attentamente rimossa. La vescica deve essere esaminata soprattutto nei neonati o nei feti abortiti: possono esserci infatti rotture, emorragie o patologie dell’uraco, derivanti da torsioni o infezioni del cordone ombelicale, che possono provocare setticemie e decesso improvviso. Se è invece presente urina, è possibile prelevarla per cistocentesi prima di aprire l’organo per una ispezione interna e, se è il caso, effettuare un esame delle urine completo.

Apparato locomotore: è indicato prendere in esame le articolazioni se alterate, effettuando un’aspirazione del liquido sinoviale ed immettendolo in provette sterili per la batteriologia od in provette con EDTA per la citologia. Di seguito è possibile esaminarle “a cielo aperto” di modo da poter asportare parti di sinovia e cartilagine articolare per un esame istologico o per la ricerca di agenti eziologici. In caso di laminite è necessario invece tagliare il piede in senso longitudinale per valutare l’anatomia delle lamine ed asportare il tessuto laminare patologico. Lo stesso vale per il tessuto muscolare che va asportato in varie sezioni longitudinali, prestando attenzione ad immettere delicatamente le fibre in formalina evitandone l’accartocciamento.

Sistema nervoso: in campo è possibile, con alcuni accorgimenti, l’esame dell’encefalo, più complesso risulterà esaminare il cervelletto e il midollo allungato per i quali sono necessari attrezzi specifici per la sezione delle parti ossee.

Per accedere alla scatola cranica, per prima cosa si asportano cute e muscoli dalla fronte, poi si taglia l’osso frontale sulla linea superiore degli occhi, formando un triangolo con altri due tagli che partono dalla linea superiore degli occhi ed arrivano ai condili occipitali lasciando all’esterno le orecchie. In questo modo si asporta la calotta cranica. Quando si accede all’encefalo, è possibile scollare le meningi ed il connettivo, asportare il cervello e visualizzarne il chiasma ottico e l’ipofisi. Se necessario, si procede a questo punto con l’enucleazione dell’occhio.

L’esame del midollo allungato, del cervelletto e del midollo spinale appare difficoltoso in campo. Un’opzione per la colonna potrebbe essere quella di effettuare delle radiografie per localizzare le porzioni patologiche e di seguito asportare ed esteriorizzare solo le 2 o 3 vertebre coinvolte dal processo patologico. Si procede poi segando il corpo vertebrale in senso trasversale, accedendo tramite le radici dei nervi alle porzioni di midollo spinale da asportare, scollandole ed immettendole in formalina.

Raccolta dei campioni: il tessuto cerebrale va immesso in formalina separatamente ed è inoltre possibile effettuare dei tamponi per batteriologia e PCR introducendoli direttamente nel parenchima dell’organo o appoggiandoli sulle meningi a livello encefalico o a livello del midollo allungato. Ricordiamo che molti esami sono possibili sul liquido cefalorachidiano (batteriologia, citologia, PCR per ricerca di agenti eziologici neuropatogeni, parametri biochimici….) e che il recupero di questo materiale non è sempre agevole nell’animale in vita.

Laboklin offre un pacchetto “Istopatologia richieste speciali – spettro d’organi” adatto alle necroscopie: viene fornito un referto unico, comprendente più di tre organi di uno stesso paziente, indipendentemente dal numero di pezzi esaminati, a prezzo particolarmente conveniente.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Il veterinario che si occupa di ortopedia equina non utilizza normalmente gli esami ematologici o dei liquidi cavitari con la stessa frequenza dei colleghi che si occupano di riproduzione, di medicina interna o sportiva; tuttavia il laboratorio può costituire un valido aiuto per le compravendite, le problematiche podoarticolari o le patologie neurologiche, sia nei puledri che nell’adulto. Vediamo in dettaglio in quali casi.

Profilo Antidoping

Indispensabile nelle compravendite o nei casi in cui ci si trovi di fronte alla necessità di valutare la presenza di farmaci o sostanze che possono alterare le performance sportive del cavallo atleta o condizionarne l’acquisto per un utilizzo sportivo importante.

Nel dettaglio possiamo testare:

• glucocorticoidi, FANS
• sedativi, tranquillanti, antidepressivi
• stimolanti, anabolizzanti

È possibile ricercare anche altre molecole, su richiesta, qualora vi sia un sospetto specifico: chiedete sempre a Laboklin informazioni dettagliate.

Tutti queste molecole vengono testate su siero, si raccomanda di spedirne una quantità di 20 ml anche qualora si volessero testare poche molecole, poiché la metodica richiede un quantitativo standard di materiale, anche per un pacchetto ridotto.

La tempistica di esecuzione è di 14-21 giorni dato che questi esami vengono effettuati da un laboratorio partner, ci sono quindi da rispettare tempi tecnici maggiori.

Laminite

Questa patologia può manifestarsi a causa di molteplici fattori, sia metabolici che anatomo-funzionali del piede equino. L’ippiatra ortopedico è spesso chiamato a gestire l’episodio acuto di infiammazione delle lamine, attuando tutte le terapie antidolorifiche, antinfiammatorie e di sostegno laminare del caso.

Non sempre la temperatura dello zoccolo o l’entità della zoppia permettono di inquadrare correttamente la gravità della situazione. Accanto quindi agli opportuni approfondimenti radiografici (radiografie del piede con venografia), il laboratorio può quindi aiutare a capire se vi è per un determinato soggetto una predisposizione metabolica alla ricorrenza degli episodi di laminite, rendendo quindi necessarie ulteriori terapie di supporto.

Vediamo quali parametri prendere in esame:

• glucosio ed insulina: diagnosticare rapidamente una iperglicemia / iperinsulinemia in un soggetto affetto da laminite permette di evidenziare una predisposizione metabolica importante per la cronicizzazione di questa patologia; anche un eccesso di cortisolo basale (Sindrome di Cushing) espone a questo rischio e i soggetti malati devono essere gestiti con una dieta a basso contenuto di carboidrati e a elevato contenuto di fibra e grassi e avranno necessità di un supporto farmacologico con pergolide.
• ACTH: permette di diagnosticare la Sindrome di Cushing che nei soggetti maturi costituisce il principale fattore di rischio per questa patologia. Elevati livelli di questo ormone determinano un eccesso di cortisolo che acuisce l’infiammazione delle lamine, rendendole vulnerabili. Questo parametro non va testato in corso di attacco acuto di laminite in quanto il suo livello risulterebbe elevato per effetto del dolore persistente e delle catecolamine circolanti, andrebbe quindi misurato dopo almeno 20 giorni dall’episodio acuto. Nel caso di un quadro clinico concordante e con iperglicemia ed iperinsulinemia persistenti, un livello elevato di questo ormone rende indispensabile l’attuazione di un’idonea terapia farmacologica per evitare l’aggravarsi od il cronicizzarsi degli episodi, con rischio aumentato di distacco della scatola cornea con inevitabile insuccesso terapeutico.
• trigliceridi: anche una iperlipidemia (predisposizione per pony ed equidi) concorre a peggiorare la sofferenza del piede e delle lamine. Una diagnosi rapida di questa condizione attraverso la misurazione di questo parametro ematologico permette di instaurare una efficace terapia endovenosa di supporto, a questo punto indispensabile per il recupero della funzionalità del piede

Patologie articolari

Quando la semeiotica indica una patologia articolare acuta, è molto importante stabilire con rapidità se ci troviamo di fronte ad una artrite settica, un’artrosi o piuttosto ad un episodio traumatico.

Questa differenziazione ci permette di intervenire con le terapie più appropriate, stabilendo con sicurezza la necessità di un’infusione di antibiotico, di solo cortisonico o acido jaluronico o se può essere sufficiente un semplice drenaggio articolare come si fa nei casi di artrite traumatica.

Un ritardo o un errore terapeutico espone infatti, soprattutto per i puledri ed per i soggetti giovani in accrescimento, a grosse problematiche di sofferenza e/o degenerazione cartilaginea che potrebbero compromettere il futuro sportivo del cavallo.

La coltura batterica del liquido sinoviale non sempre fornisce risultati positivi e un’assenza di crescita non permette di escludere con sicurezza la sepsi: la presenza di pochi batteri fagocitati, il sequestro di microrganismi nelle membrane sinoviali o l’infusione locoregionale di antibiotici per altre problematiche concomitanti, potrebbero ritardare o rendere difficoltosa la corretta diagnosi di artrite settica.

Laboklin dispone di un profilo dedicato alla citologia e biochimica del liquido sinoviale, in particolare vengono presi in esame:

• proteine totali: molto elevate se ci si trova di fronte ad un essudato o se vi è presenza di fibrina o materiale purulento, quindi di infezione
• peso specifico: risulta elevato se c’è sepsi
• pH: risulta basso, quindi acido in caso di artriti settiche
• conta cellulare e presenza di emazie: se le cellule della serie bianca sono presenti in concentrazione elevata, con generica predominanza di neutrofili, possiamo sospettare un’artrite settica. Viceversa, la presenza di sole emazie e una conta cellulare bassa, farebbe piuttosto pensare ad un’eziologia prettamente traumatica
• lattati e siero amiloide: sono parametri biochimici che possono essere misurati anche su un liquido sinoviale di aspetto normale ed in buono stato (assenza di pus, fibrina ed emazie). Valori elevati di questi due parametri suggeriscono la presenza di proliferazione batterica.
• glucosio: risulta basso in caso di presenza di batteri (che lo utilizzano come fonte energetica).

Decubito

In un soggetto in decubito andrebbero sempre valutati l’apparato muscoloscheletrico e nervoso, applicando quindi differenti iter diagnostici.

Una volta esclusi grossi traumi, fratture, patologie addominali acute o laminite, vediamo in dettaglio quali test utilizzare.

Sindromi neurologiche

Vediamo come diagnosticare la presenza di virus neuropatogeni:

• West Nile Virus: possiamo testare il titolo anticorpale IgM ed IgG su siero e la PCR su liquor e sangue intero EDTA
• Malattia di Borna: testiamo il titolo anticorpale su siero e la PCR su liquor e sangue intero EDTA
• Herpesvirus equini: testiamo il titolo anticorpale su siero e la PCR su tampone faringeo, tessuto, sangue intero EDTA e liquor
• Encefaliti da zecche: valutiamo il titolo IgM ed IgG su siero e liquor e anche PCR su siero, zecca e liquor

Sindromi muscolari

In questi casi possiamo approfondire con vari pacchetti:

• Profilo disturbi muscolari: comprende vari enzimi ed elettroliti, vitamina E e Selenio
• Profilo cardiaco: vengono testati gli enzimi della muscolatura cardiaca ed alcuni elettroliti
• Malattie genetiche che coinvolgono la muscolatura:
• HYPP (Paralisi periodica iperkaliemica),
• IMM/MYHM (miosite / miopatia),
• GBED (Deficit dell‘enzima per la ramificazione del glicogeno),
• Miotonia

I test genetici si effettuano su sangue intero in EDTA.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Nei parti non assistiti ci si può trovare di fronte ad un puledro che sembra clinicamente normale ma che, avendo sofferto durante la nascita o a causa di un ambiente uterino patologico, potrebbe mostrare delle alterazioni clinico-metaboliche importanti dopo le prime 24-48 ore.

Vediamo quali parametri di laboratorio si alterano precocemente e possono quindi aiutarci a prendere delle decisioni tempestive, prima dell’aggravarsi dei sintomi.

Distocia / Red bag disease

Dopo questo evento (distacco placentare prematuro con ipossia fetale) possiamo trovarci di fronte a puledri che, pur avendo sofferto un insulto ipossico, appaiono normali.

• Creatinina: questo parametro risulta normalmente elevato nel puledro neonato, è presente nel liquido amniotico e se si è verificata un’aspirazione al momento del parto od un’ipossia, tende a non abbassarsi col passare delle ore.
• Creatinchinasi e lattati: questi due parametri si innalzano – e permangono elevati – nei soggetti che rimangono in decubito per molte ore. Costituiscono un segno precoce di patologia, non sempre notato dal proprietario al momento della visita.

Deficit di trasferimento passivo di immunità

Si verifica quando il puledro non si alimenta normalmente nelle primissime ore di vita, perdendo la possibilità di assumere anticorpi con il colostro.

Si tratta di una condizione che espone il neonato all’insorgenza di infezioni e setticemia.

L’unico modo per prevenire complicanze è una diagnosi precoce di questa condizione, ottenibile misurando il livello di anticorpi nel sangue:

• misurazione delle IgG: è possibile effettuare un test per la misurazione di anticorpi ematici già a circa a 16 / 18 ore dopo la nascita, in quanto l’assorbimento enterico dopo questo lasso di tempo è molto basso.

Se si riscontra un livello di anticorpi insufficiente (al di sotto dei 400 ng/dl), è possibile intervenire con la somministrazione parenterale di plasma iperimmune.

• glicemia: risulta sempre piuttosto bassa (al di sotto di 90 mg/dl) nei puledri che non si alimentano normalmente

Anche questo può farci capire se vi è stata una regolare assunzione di colostro nelle ore precedenti la visita.

Infiammazione e setticemia

Se sospettiamo questa condizione – che nel puledro si verifica anche in assenza di febbre e di una sintomatologia chiara – possiamo effettuare questi esami:

• esame emocromocitometrico: non sempre è indicativo in questi casi, possiamo infatti avere sia leucopenia che un livello normale di leucociti, raramente leucocitosi in quanto il neonato non ha molta reattività immunologica
• amiloide sierica: si tratta di un parametro molto affidabile per diagnosticare la presenza di infezione. I suoi livelli si alzano molto velocemente (e si abbassano altrettanto velocemente in caso di risposta alla terapia antibiotica) nell’arco di 12 ore, permettendo uno stretto monitoraggio della situazione clinica del soggetto a rischio, prima dell’aggravarsi della patologia, quando la condizione metabolica del neonato potrebbe essere già irrimediabilmente compromessa.
• fibrinogeno: anche questo parametro è utile. Veniva molto utilizzato in passato nella gestione dei soggetti setticemici, si innalza però con minor prontezza e si abbassa nell’arco di 2–3 giorni.

Isoeritrolisi neonatale

Si tratta di una condizione derivata dalla incompatibilità tra i globuli rossi del puledro ed il siero – e quindi il colostro – materno, caratterizzata da emolisi massiva, ittero, anemia, debolezza che insorgono tipicamente intorno ai 3–4 giorni di vita dopo l’assunzione degli anticorpi tramite il colostro.

Il quadro clinico appare solitamente molto chiaro, gli esami ematologici supportano in modo deciso la diagnosi con il riscontro di una spiccata anemia ed un aumento deciso della bilirubina indiretta, il siero e le mucose appaiono inoltre decisamente itteriche.

Prematurità e dismaturità

Si tratta di soggetti che non sono maturati a sufficienza o per patologie uteroplacentari (dismaturi a termine) o per aver dovuto lasciare l’ambiente uterino in anticipo (prematuri). Di solito il sistema immunitario e il sistema nervoso sono molto compromessi in questi pazienti che, per questo motivo, necessitano di cure infermieristiche intense nei primi giorni di vita.

Non disponiamo di molti parametri che ci permettano di diagnosticare questa condizione con sicurezza. Un attento esame clinico e la valutazione approfondita della condizione metabolica permettono di inquadrare con maggior precisione la situazione, in particolare sono riscontri tipici:

• debolezza, peso insufficiente, difficoltà ad alzarsi ed assenza di riflesso della suzione, poco pelo, coda e criniera molto corti od assenti
• placenta anormale per peso, aspetto, rottura non in corrispondenza della stella cervicale ma in altre localizzazioni, presenza di ematomi diffusi
• lacerazioni vulvari nella madre
• aspetto letargico o viceversa iperattività del puledro
• lassità legamentosa, orecchie pendule e fronte bombata

Sono riscontri di laboratorio comuni invece:

• linfopenia generale con rapporto neutrofili / linfociti < 1,5 (nei puledri a termine è di solito > 3)
• proteine totali ematiche prima della poppata < di 5 gr/dl
• una leggera iperbilirubinemia (indiretta) dovuta all’aumentato catabolismo dei globuli rossi fetali che permane oltre i primi giorni di vita
• la bilirubina e le ggt molto elevate indicano un’insufficiente funzionalità epatica
• un’iperglicemia persistente dopo la poppata è sintomo di un deficit di regolazione del metabolismo dovuto generalmente ad un eccesso di catecolamine circolanti
• un’ipoglicemia persistente indica invece un’insufficiente od irregolare assunzione di latte
• creatinina: è un parametro che può riscontrarsi elevato nel puledro neonato normale, fino a 3–4 mg/dl nelle prime 36 ore, poi decresce in condizioni fisiologiche. Se permane alterato potrebbe indicare una patologia renale (di solito conseguente ad ipossia) od una sofferenza placentale pregressa.

Lo stesso trend si riscontra nei valori di azotemia, che si abbassa per effetto dell’intenso metabolismo aminoacidico tipico delle fasi di crescita veloce di questi soggetti, quando sono esenti da patologie.

Ritenzione di meconio

Questa patologia è di solito clinicamente evidente per frequente tenesmo e mancanza di feci del puledro nel box, alcune volte però il blocco può essere molto craniale e non evidente alla palpazione digitale del retto, quindi sono necessari ulteriori approfondimenti diagnostici (ecografia o radiografia addominale).

In questi casi anche alcuni parametri di laboratorio ci aiutano nella gestione medica di questa condizione oppure, viceversa, possono indirizzarci verso una chirurgia, evento raro ma possibile:

• ematocrito elevato, iperazotemia ed iperproteinemia: indicano disidratazione e necessità di una fluidoterapia aggressiva
• leucocitosi / linfopenia, iperglicemia: indicano uno stress metabolico importante, derivato dal fatto che questi puledri non assumono regolarmente il latte per effetto della tensione e dolorabilità addominale
• lattati: un valore persistentemente elevato o comunque al di sopra dei 2 mmol/l indica grave compromissione del transito intestinale con sofferenza vascolare viscerale e rischio di rottura.

Tutti questi parametri alterati indicano la necessità di un intervento tempestivo di supporto, non escludendo una chirurgia per la rimozione del meconio.

Rottura di vescica

Anche in questo caso la diagnosi è prettamente clinica (assenza o scarsa produzione di urina, tenesmo, ingrossamento “a botte” dell’addome in assenza di dolore acuto, uraco pervio, tachicardia, dispnea.

La diagnosi certa si effettua con l’ausilio dell’ecografia ma, quando questa non risulta disponibile, la medicina di laboratorio può fornire delle indicazioni importanti tramite il riscontro di questi parametri:

• iponatriemia ed ipercaliemia: sono disturbi elettrolitici ematici derivanti dall’accumulo di urina nell’addome
• creatinina ematica: questo valore si innalza per effetto della mancata eliminazione dei cataboliti urinari.

Centesi peritoneale

Si tratta di una procedura diagnostica sicura anche nel neonato che permette la raccolta e l’analisi del fluido peritoneale; un aumento di potassio, fosforo, un rapporto creatinina peritoneale / creatinina ematica > 2:1 e soprattutto la presenza di urina, sangue o materiale alimentare, permettono di diagnosticare con sicurezza una rottura vescicale od enterica nei casi di addome acuto.

Il drenaggio del liquido presente in addome permette inoltre di stabilizzare il soggetto in attesa della chirurgia.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Il parto nella cavalla è un momento molto delicato. Numerose problematiche possono infatti presentarsi durante questo evento e in campo è particolarmente importante cercare di anticipare prima possibile l’insorgenza di patologie, per poter gestire al meglio ogni evenienza.

Vediamo come il laboratorio può aiutarci a prendere le decisioni terapeutiche migliori nella gestione della fattrice in questo momento particolare, ovvero in prossimità del parto.

Dolore addominale

La fattrice nel pre o postpartum presenta una maggior incidenza di colica addominale per effetto di aderenze e compressioni dovute al parto (soprattutto se laborioso o distocico) e per il fatto che viene a mancare piuttosto velocemente l’ingombro dell’utero gravido, lasciando una parte di addome improvvisamente libera.

• Esame emocromocitometrico: utile per stabilire se vi sono rotture vasali con emorragie interne che potrebbero essere responsabili della sintomatologia, oppure emoconcentrazione con rialzo dell’ematocrito in caso di gravi patologie enteriche
• Lattati: permettono di diagnosticare precocemente la presenza di necrosi ischemiche di tipo compressivo e di compromissione viscerale sia conseguenti a coliche che successive al parto. Come regola generale dobbiamo considerare piuttosto il trend (che deve essere in discesa) rispetto al valore assoluto di questo parametro.
• Centesi peritoneale: da effettuarsi in tutti i casi di dolore addominale – anche lieve – di origine non chiara. Infatti un’attenta analisi del liquido peritoneale permette di diagnosticare rotture viscerali, emorragie, peritoniti settiche. Ricordiamo che l’esplorazione rettale della fattrice a termine o che ha appena partorito, non sempre fornisce informazioni utili a comprendere la situazione degli organi interni, a causa dell’ingombro dell’utero non ancora involuto.

Dobbiamo ricordare che nella fattrice durante il postpartum possiamo avere dolorabilità addominale similcolica dovuta ad altre cause, che andrebbero escluse con un’attenta visita clinica: ematomi perineali, lacerazioni uretro-vaginali, fistole rettali, tossicosi da endometrite per ritenzione placentare o emorragia endometriale (non sempre risulta uno scolo visibile), lesioni neurologiche di tipo compressivo con microfratture a carico del bacino o del treno posteriore, ernia diaframmatica.

Laminite

Questa patologia costituisce una grave sequela del parto anche eutocico, più frequente nei soggetti pesanti o predisposti. I fattori di rischio possono essere metabolici od anatomofunzionali: per capire se ci troviamo di fronte ad un disordine metabolico che acuisce queste problematiche possiamo eseguire i seguenti test ematologici:

• trigliceridi: una diagnosi precoce di iperlipidemia (soprattutto nelle razze toy ed equidi) permette di instaurare una pronta terapia endovenosa a supporto del metabolismo dei glucidi, con conseguente arresto della mobilizzazione dei grassi. Questo favorisce un recupero della condizione di normalità, presupposto indispensabile per evitare l’insorgenza di infiammazione e il distacco delle lamine dello zoccolo.
• Glucosio: una iperglicemia/iperinsulinemia persistente, dovuta al rapido rilascio di catecolamine, ad errori dietetici o alla presenza di un eccesso di cortisolo basale (Sindrome di Cushing), agisce in sinergia nello scatenare un attacco di laminite in soggetti predisposti. Il monitoraggio di questo parametro permette l’impostazione di un corretto regime dietetico volto ad evitare l’insorgenza di pericolosi picchi ematici di zuccheri in questi soggetti metabolicamente delicati.

Dal punto di vista clinico dobbiamo sempre controllare la temperatura dello zoccolo nella fattrici che hanno appena partorito, che mostrano zoppia, che tendono a stare in decubito o mostrano scarso appetito, soprattutto se in sovrappeso o con scarsa conformazione e cura del piede.

L’eventuale misurazione di ACTH per la corretta diagnosi di Sindrome di Cushing va ovviamente rimandata di almeno 10 / 15 giorni post parto (i livelli di questo ormone si elevano sempre in occasione di dolore acuto o di eventi stressanti).

Necrosi da riperfusione

In caso di parto difficile, distocia grave o nascita di un puledro particolarmente grande, dopo le lacerazioni e gli ematomi in sede vaginale possiamo avere gravi fenomeni necrotici da riperfusione. Questi eventi possono interessare sia i tessuti delle vie genitali (utero e canale del parto) che dell’ultimo tratto intestinale, con annessa peritonite da trazione o lacerazione delle sierose.

Di solito la fattrice si presenta apatica e riluttante a muoversi, non dimostra interesse al puledro e può manifestare febbre, dolori colici e diarrea, oppure scoli maleodoranti dalla vagina. Questa sintomatologia diventa di solito evidente dopo 48–72 ore dall’evento compressivo, molto spesso purtroppo si richiede un’eutanasia in quanto le porzioni di tessuto coinvolte sono ampie e pertanto nessuna terapia appare risolutiva, specialmente in caso di peritonite concomitante.

• Esame emocromocitometrico: si riscontra di solito netto rialzo della serie bianca ed un aumento dell’ematocrito.
• Amiloide sierica: di solito decisamente aumentata, per effetto della setticemia.
• Lattati: anche in questi casi decisamente elevati in valore assoluto, con trend in crescita, a causa dei gravi fenomeni necrotici associati alla sofferenza vascolare.

Ipocalcemia

Si tratta di un’evenienza non molto frequente nella cavalla, tuttavia descritta soprattutto nelle razze pesanti in soggetti obesi al momento dell’inizio della lattazione (2 o 3 giorni post parto) a causa dell’imponente stress metabolico che questa condizione provoca.

La fattrice mostra bassi livelli di calcio in circolo a causa di un deficit di mobilizzazione dal tessuto osseo, una carenza di tipo alimentare oppure come effetto rebound dopo un’eccessiva supplementazione preparto o ancora in caso di stress da trasporto, insufficienza renale, bassi livelli di PTH.

La sintomatologia comprende fascicolazioni muscolari, stato d’ansia, salivazione, aritmie cardiache, difficoltà nella masticazione. Nelle forme gravi possiamo invece avere anoressia, decubito, rigidità, prolasso della terza palpebra e anche morte.

• Calcio ionizzato, magnesio e PTH: mostrano in questi casi un livello molto basso.
• Enzimi muscolari: sono di solito molto elevati a causa delle fascicolazioni e del decubito.

Si consiglia una pronta integrazione di calcio per via endovenosa, con monitoraggio di questo parametro per evitare pericolosi sovradosaggi.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Le sindromi da malassorbimento rappresentano una notevole sfida diagnostica per il veterinario ippiatra poiché possono essere dovute a molte patologie diverse. Il laboratorio è di grande aiuto in questi casi nella localizzazione del problema, dato che la consueta diagnostica per immagini nel cavallo è poco decisiva per ovvi limiti dimensionali, contrariamente a quanto succede per la clinica dei piccoli animali.

Gastriti ed ulcere gastriche

I soggetti affetti da queste patologie sono spesso asintomatici: coliche leggere, appetito altalenante, pelo opaco, ritardi di crescita nei puledri, anemia, episodi diarroici possono anche essere assenti in cavalli con gravi ulcerazioni.

La compromissione della mucosa gastrica può modificare la normale funzionalità del tratto intestinale in toto, poiché si verificano alterazioni del transito di ingesta, con abbassamento del pH, mutazione delle dinamiche fermentative e squilibri della microflora che si ripercuotono poi su tutta la digestione, anche nel tratto distale.

• Il gold standard per la diagnostica delle patologie dello stomaco è ovviamente la gastroscopia, vediamo però quali esami di laboratorio possono affiancare il veterinario clinico come ausilio ad una corretta diagnosi.

Esame emocromocitometrico: lo stillicidio causato dalla presenza di ulcere potrebbe dare un’anemia cronica (normocitica normocromica). La serie bianca di solito non risulta alterata, soprattutto nei soggetti adulti.

Proteine totali ed elettroforesi: in caso di gastrite con soluzione di continuità della mucosa, le proteine totali tendono ad essere basse a causa della perdita ematica cronica. Effettuare un’elettroforesi aiuta molto nel discernere il tipo di componente proteica presente in circolo. Nelle forme croniche infatti il picco delle albumine è generalmente basso e potrebbe rilevarsi invece un picco elevato delle globuline come effetto dell’infiammazione della mucosa.

Amiloide sierica e fibrinogeno: sono di solito poco indicativi per carenza di sintesi proteica.

Piastrine: si verifica di frequente una ipopiastrinemia a causa della perdita ematica cronica.

Malattia infiammatoria intestinale cronica (CIBD)

Si tratta di una serie di patologie enteriche ad andamento cronico progressivo, che determinano dimagrimento da perdita di proteine o da malassorbimento delle sostanze nutritizie, senza grosse variazioni di appetito, in assenza di dolore addominale o altri sintomi clinici definiti.

Il gruppo di queste enteriti dette “protidodisperdenti” comprende: le enteriti eosinofiliche e granulomatose, le enteriti linfoplasmacellulari, la malattia eosinofilica multisistemica se sono coinvolti gli altri organi cavitari o la cute.

La patogenesi di queste enteriti non è ancora completamente chiara: si pensa a disordini immunitari, a infezioni od infestioni subcliniche croniche, ad una predisposizione genetica.

Esame delle feci: di solito non fornisce informazioni utili alla diagnosi, occorre effettuarlo comunque per escludere le infestioni parassitarie che potrebbero causare la stessa sintomatologia.

Esame emocromocitometrico: di solito si riscontra un’anemia rigenerativa, la serie bianca potrebbe essere leggermente aumentata oppure nella norma (anche in caso di enterite eosinofilica o linfoma alimentare il livello ematico della serie bianca non subisce grossi rialzi).

Esame biochimico: gli enzimi epatici e renali sono di solito nella norma, mentre invece urea, calcio e fosfatasi alcalina sono spesso aumentati per effetto dell’intenso catabolismo proteico muscolare, comune nel dimagrimento progressivo tipico di queste sindromi.

Proteine totali ed elettroforesi: possiamo avere ipoalbuminemia, iperglobulinemia, iperfibrinogemia (se non presente ipoalbuminemia grave).

Dimensione delle particelle fecali: possono dare un’indicazione per quanto riguarda la funzionalità del grosso intestino e permettono di diagnosticare una disbiosi ed alterazioni del transito, ma anche indirizzarci verso patologie dentarie che non permettono la corretta frantumazione ed assimilazione dell’alimento.

Sangue occulto nelle feci: indica in modo molto generico la presenza di infiammazione con soluzione di continuità della mucosa enterica, senza però fornire alcuna indicazione per la localizzazione del problema. Purtroppo questo esame ha dei grossi limiti dovuti alla elevata quantità di materiale fecale prodotto da un equino nell’arco della giornata e dalla notevole lunghezza dell’intestino che rende possibile la degradazione del sangue lungo questo percorso. Un esame negativo non esclude pertanto la presenza di lesioni, soprattutto se a carico del primo tratto.

La medesima cautela deve essere utilizzata nell’esecuzione di un esame citologico fecale per la ricerca di cellule neoplastiche o della serie bianca che, se rilevate, suggeriscono piuttosto la presenza di patologia dell’ultimo tratto, ma non si possono escludere problemi presenti nei primi tratti anche qualora l’esame citologico delle feci dovesse dare scarse informazioni.

Centesi: un esame citologico del liquido peritoneale (strisciando il pellet ottenuto dopo centrifugazione, sempre necessaria poiché si tratta di liquido con poca cellularità) potrebbe fornire delle indicazioni utili se si riscontra la presenza di cellule di esfoliazione patologiche o eritrociti. Un esame batteriologico invece è raramente indicativo per le forme croniche (vedi approfondimento “Centesi” – Luglio 2019). Su questo materiale è anche possibile la valutazione di alcuni parametri biochimici.

Biopsia ed esame istologico della mucosa enterica: si tratta di un esame piuttosto attendibile per la diagnosi, ma con alcune precisazioni sul tipo di prelievo:

• approccio rettale: di solito viene effettuato con pinza da biopsia e con prelievo “alla cieca”, quindi la porzione di mucosa accessibile è molto limitata e per questi motivi un esito negativo non esclude la patologia
• approccio chirurgico: permette di effettuare una biopsia a pieno spessore di tutti i tratti di mucosa che appaiono patologici ad un esame visivo diretto, con un’ottima resa diagnostica ma purtroppo è utilizzabile solo sul tavolo operatorio
• approccio laparoscopico: permette la scelta della porzione di tratto gastroenterico da prelevare nel paziente in stazione, utilizzando un apposito endoscopio, con metodica più veloce, sicura e meno invasiva rispetto alla precedente.

I campioni bioptici prelevati vanno inviati al laboratorio negli appositi contenitori protetti, contenenti formalina al 5%.

Ricordiamo che un esame istologico di più parti di uno stesso distretto, per quel dato paziente e finalizzati alla medesima diagnosi, vengono conteggiati come un esame istologico unico (richiedici il dettaglio dei costi).

L’istologia di questi tessuti potrebbe rilevare la presenza di:

• lesioni granulomatose diffuse con infiltrato cellulare di eosinofili, linfociti, macrofagi, plasmacellule e cellule giganti a livello della lamina propria se presente CIBD
• infiltrato di cellule neoplastiche in caso di linfosarcoma alimentare
• atrofia marcata dei villi intestinali in caso di paziente geriatrico.

Linfoma alimentare

Questa neoplasia si presenta con le medesime caratteristiche cliniche delle enteropatie croniche e la localizzazione addominale è particolarmente frequente nel cavallo, non solo anziano.

Si manifesta generalmente con un infiltrato linfoide diffuso della parente dell’intestino. In alcuni casi si possono rilevare delle masse addominali od un coinvolgimento dei linfonodi mesenterici od anche superficiali.

La mucosa compromessa perde la propria funzionalità e possiamo avere malassorbimento, diarrea o feci poco formate, enteropatia protidodisperdente, colichette ricorrenti od anche semplicemente dimagrimento progressivo senza altri sintomi evidenti.

Esame emocromocitometrico: possiamo riscontrare anemia e rialzo persistente della serie bianca

Proteine totali ed elettroforesi: si rileva generalmente ipoalbuminemia, iperglobulinemia con picco monoclonale delle IgG ed abbassamento delle IgM, dovuto alla proliferazione di un tipo predominante di linfociti neoplastici.

Esame biochimico: potrebbe verificarsi un deciso rialzo della fosfatasi alcalina e dei parametri renali per effetto dell’importante catabolismo proteico che accompagna il dimagrimento cronico.

Centesi: un esame citologico del liquido peritoneale dopo centrifugazione potrebbe rilevare alcune cellule neoplastiche.

Biopsia ed esame istologico della mucosa enterica: si tratta di un esame diagnostico, con le medesime precisazioni esposte per le CIBD, in questo caso potremmo anche effettuare un agoaspirato o una biopsia escissionale dei linfonodi esplorabili, nel caso in cui fossero ingrossati.

Test dinamici: test di assorbimento orale del glucosio

Si tratta di un test molto semplice e poco invasivo, utile per valutare un eventuale deficit di funzione della mucosa del primo tratto gastro-intestinale. Elenco i vari passaggi:

• si valuta il peso del soggetto con apposite formule metriche o meglio pesandolo direttamente
• si attua un digiuno di 12 ore, con solo acqua a disposizione fino a 2 ore prima del test
• si prepara una soluzione di glucosio sciogliendo 100 gr di polvere / 100 kg di peso vivo, allestendo una soluzione al 20% in volume di acqua tiepida
• si effettua un prelievo di sangue al tempo “0”, prima di somministrare la soluzione glucosata, e lo si considera come livello basale
• si somministra la soluzione in bolo, tramite sonda nasogastrica
• si effettuano 3 o 5 prelievi seriali a: 30’ – 60’ – 90’ – 120’ – 180’ minuti dalla sonda
• si analizzano i campioni immediatamente tramite un glucometro portatile, oppure si immette il sangue in provette NaF (tappo grigio), che rendono stabile le glicemie fino a 48 ore e ne permettono l’invio presso il laboratorio.

Importante in questi casi avere l’accortezza di identificare serialmente ogni provetta con precisione.

Interpretazione

• Curva normale – si verifica un picco di glicemia con un deciso aumento (più 180% – 200% rispetto ai livelli basali ) entro le prime 2 ore.

Successivamente si rileva un abbassamento graduale ed un rientro completo ai livelli basali dovuto al conseguente rilascio di insulina. I livelli di glucosio si devono normalizzare entro le successive 6 ore (se non vi sono concomitanti fenomeni di insulino-resistenza).

• Svuotamento gastrico ritardato: si possono osservare più picchi glicemici di andamento regolare successivi al primo.
• Malassorbimento grave: non è possibile rilevare alcun picco glicemico – questo è indice di grave patologia enterica (CIBD o linfoma).
• Quadri intermedi: di solito dovuti a parassiti, gastriti croniche o duodeniti, o disturbi lievi di transito.

Questo test ci avvantaggia anche se è negativo: significa che la nostra attenzione diagnostica deve spostarsi sul tratto distale dell’intestino o verso altri apparati, oppure può essere utilizzato per monitorare la progressione del paziente in corso di terapia.

Dott.ssa Susanna Mereghetti

Il laboratorio può venire in aiuto al veterinario ippiatra alle prese con le patologie del tratto gastroenterico, nel caso in cui ci siano da prendere decisioni importanti.

Dividiamo innanzitutto le patologie che interessano questo tratto in acute e croniche e vediamo in quali situazioni risulta d’aiuto affidarsi ad alcuni parametri di laboratorio, ormai disponibili rapidamente anche sul campo.

Coliche chirurgiche vs mediche

Nella clinica del cavallo la gestione delle coliche è un’evenienza purtroppo frequente, per fortuna la maggior parte di questi casi si risolve con un’opportuna terapia medica, senza ricoverare l’animale per una chirurgia. Per questo motivo è di fondamentale importanza arrivare quanto prima alla diagnosi di colica che necessita di terapia chirurgica, in modo da potere indirizzare velocemente alla struttura più vicina il paziente prima che la situazione fisico-metabolica risulti irrimediabilmente compromessa.

Vediamo quali parametri clinici e di laboratorio ci aiutano a discriminare questi casi.

Dolore e risposta alla terapia analgesica
L’entità dello stimolo algico non è sempre facilmente interpretabile essendo soggettive le manifestazioni di dolore. I parametri clinici ad esso associati sono la sudorazione profusa, il rotolamento, il rampare o guardarsi i fianchi, lo sguardo fisso, la tachicardia oltre i 45 battiti / minuto, il decubito prolungato, il flehmen, l’anoressia (anche se a volte un cavallo in colica può prendere l’alimento e masticarlo per una sorta di reazione allo stress). Purtroppo nessun parametro di laboratorio può aiutarci in questa valutazione, che dipende dalla sensibilità e pratica del clinico e dalla dimestichezza nel dosare ed utilizzare le molecole antidolorifiche più adatte.

Disidratazione e tossicosi
In caso di colica, le ingesta ferme nel lume intestinale richiamano liquidi dall’interstizio causando disidratazione, blocco ulteriore del transito con formazione di tossine che vengono assorbite dalla mucosa intestinale verso il circolo ematico. Questo quadro provoca un aumento del tempo di riempimento capillare, mucose congeste e prova della plica cutanea positiva.

• Diagnostica di laboratorio: per fortuna molti parametri ci aiutano nel monitorare la condizione di idratazione / tossicosi del soggetto.

Ematocrito: possiamo valutarlo sia tramite un contaglobuli come anche direttamente lasciando sedimentare la provetta con anticoagulante in posizione eretta, confrontando serialmente la parte corpuscolata del sangue, che dovrebbe rimanere entro il 40%. Se l’ematocrito aumenta od arriva oltre il 50%, è indicata sicuramente una fluidoterapia aggressiva.

La serie bianca di solito nei casi di colica acuta non mostra particolari alterazioni.

Proteine totali: permettono di monitorare la terapia endovenosa per evitare la formazione di edemi da sovraccarico di fluidi – specialmente se fatti troppo rapidamente o nel caso in cui si utilizzino soluzioni ipertoniche – in quanto il rischio di creare gravi squilibri elettrolitici e metabolici non è remoto. Un valore di proteine totali inferiore a 5 g/dl impone cautela nella somministrazione di fluidi, viceversa un valore oltre 7,5 g/dl con ematocrito elevato indica grave disidratazione. Può succedere che una pregressa anemia possa mascherare una seria mancanza di liquidi (l’ematocrito non si alza essendoci pochi globuli rossi in circolo): in questi casi la decisione di attuare idonea fluidoterapia andrebbe presa sulla base del valore di proteine totali.

Lattati: riflettendo la glicolisi anaerobica, misurano l’entità dell’ipossia tissutale sofferta dal viscere, la sepsi e l’intossicazione protratta e quindi possono indirizzare verso una terapia chirurgica / eutanasia nei casi borderline, senza temporeggiare. Come vedremo più avanti, possiamo inoltre confrontare il valore ematico rilevato con quello peritoneale (se si effettua una centesi addominale).
Valori normali si attestano al di sotto dei 2 mmol/l; livelli sopra 1,7 mmol/l – in assenza di sintomi clinici evidenti – indicano comunque necessità di fluidi; valori con trend di crescita oltre questa soglia, soprattutto dopo fluidoterapia, devono far pensare ad una colica chirurgica; valori oltre i 7 mmol/L indicano prognosi infausta.

Questi parametri si modificano piuttosto rapidamente: si consiglia una misurazione ogni 4 – 6 ore e dopo almeno 3 ore dalla somministrazione di Ringer lattato per via endovenosa.

Glicemia: i cavalli che soffrono di colica mostrano iperglicemia persistente dovuta a rilascio di catecolamine, cortisolo, prostaglandine. Questo è uno dei fattori principali che espone i soggetti ad episodi di laminite conseguenti a colica, assieme alla tossicosi. Non vi sono valori di riferimento particolari, solamente l’indicazione che una iperglicemia persistente comporta una prognosi peggiore – indicando la presenza di una compromissione metabolica grave – rispetto ad un soggetto che riesce a controllare efficacemente il livello di zuccheri nel sangue in corso di addome acuto.

Coliti e diarrea acuta nell’adulto

I cavalli con diarrea possono non mostrare particolare dolorabilità, appaiono più frequentemente letargici, con mucose congeste, disidratati e possono avere febbre. Anche una grave diarrea liquida potrebbe presentarsi come sintomo in un secondo momento e, all’esplorazione rettale, quando possibile, potremmo avere, in fase iniziale, reperti suggestivi di una costipazione.

L’ascoltazione potrebbe rilevare una riduzione dei borborigmi e della motilità, l’esame ecografico invece rileverebbe facilmente la presenza di anse dilatate e ripiene di liquido.

Le coliti più leggere si manifestano con la produzione di feci poco formate o diarroiche, maleodoranti e l’animale può mostrare appetito conservato e sete intensa.

In questi casi la presenza di garretti e pareti del box sporchi di feci liquide con assenza di fiande nella lettiera permettono la diagnosi con una certa sicurezza.

In prima battuta si attua un’idonea idratazione, sia per sonda (nei casi lievi) che tramite fluidi per via endovenosa, in quanto la mancanza di liquidi e la trasmigrazione di tossine dal lume intestinale per effetto della proliferazione batterica e delle fermentazioni anomale è un evento tutt’altro che remoto.

Sono disponibili preparazioni ad azione sintomatica, da somministrare per os con agenti adsorbenti, compattanti, elettroliti e lieviti per arginare la diarrea, riequilibrare la flora intestinale compromessa, ed evitare l’insorgenza di shock da perdita di liquidi e proteine, in attesa della diagnosi eziologica.

Complicanze frequenti sono la setticemia, la laminite, la coagulazione intravasale disseminata o CID, il blocco intestinale o l’insufficienza renale da disidratazione e tossicosi. Questi soggetti vanno pertanto monitorati strettamente e isolati per evitare il contagio di altri cavalli presenti in scuderia, contagio causato dalla dispersione di tossine e batteri tramite le feci e la lettiera.

• Vediamo quali parametri di laboratorio ci vengono in aiuto per la gestione di questi pazienti:

Ematocrito seriale: per la valutazione della disidratazione e della tossicosi (se molto intossicati, il sangue con anticoagulante non si separa nemmeno).

Proteine totali: nelle diarree acute si riscontra sovente ipoproteinemia (con ipoalbuminemia ed ipoglobulinemia associate) da perdita enterica. La fluidoterapia andrebbe quindi calibrata attentamente ed utilizzata in aggiunta alla somministrazione di plasma per evitare l’eccessiva diminuzione della pressione colloidoosmotica, che provoca travaso di liquido nell’interstizio con formazione di edemi.

WBC: nei casi di colite e diarrea con peritonite settica, possiamo avere un rialzo importante della serie bianca e di altri marker infiammatori come amiloide sierica e fibrinogeno. Viceversa, nei casi iperacuti, si verifica più spesso leucopenia con predominanza di neutrofili tossici.

Piastrine e fibrinogeno: una marcata piastrinopenia potrebbe indicare un’attivazione anomala della cascata coagulativa con pericolo di trombosi. La prognosi in questi casi appare sfavorevole. La valutazione delle piastrine va però effettuata nell’arco di poche ore dal prelievo perché la presenza di anticoagulante tende a formare degli aggregati piastrinici.

Lo stato generale di ipercoagulabilità sistemica è causato dalla perdita di fattori di regolazione dalla mucosa enterica danneggiata, dall’iperfibrinogemia e dallo stato di generale infiammazione / ischemia intestinale.

Lattati: la situazione metabolica si modifica molto velocemente. Come valori di riferimento, a parte il trend che deve essere di decremento costante, abbiamo anche in questi casi il limite di 2,5 mmol/l, oltre il quale la situazione appare critica, con indicazioni per una prognosi infausta.

Creatinina, azotemia e ps urinario: la disidratazione protratta e la tossicosi tipiche di questa patologia compromettono facilmente la funzionalità renale. Una valutazione della condizione glomerulare attraverso la misurazione della creatinina ematica o del ps urinario – che nelle prime fasi di sofferenza del tubulo renale si abbassa – è importante per la prognosi.
Un’iperazotemia persistente indica intossicazione ed è responsabile dello stato di apatia e letargia di alcuni di questi soggetti.

La valutazione dello stato degli emuntori risulta particolarmente importante qualora si decida di utilizzare antibiotici aminoglicosidici e FANS per lunghi periodi.

Esame delle feci: nei casi di diarrea la proliferazione batterica e virale intestinale – con relativo passaggio di tossine in circolo dalla mucosa danneggiata – costituisce evenienza come abbiamo detto spesso, quindi un accurato esame fecale con ricerca di virus, batteri e parassiti patogeni appare indispensabile per impostare la corretta terapia.

Laboklin dispone di un “Profilo feci” per l’adulto e per il puledro, con ricerca di tutti i principali agenti patogeni e tossine che possono causare diarrea.

Centesi addominale

Utile in caso di addome acuto, per decidere se affrontare una chirurgia nei casi dubbi e per arrivare velocemente ad una diagnosi in tutti i casi di patologia addominale. Nelle diarree acute si consiglia di effettuarla solo se si sospetta una peritonite.

• I parametri da prendere in considerazione una volta recuperato il liquido peritoneale, sono elencati qui di seguito.

Aspetto: il colore normale del liquido peritoneale è citrino chiaro. La presenza di sangue, materiale alimentare o feci indica rottura viscerale (bisogna però essere certi di non aver inavvertitamente punto un viscere), con indicazione per una chirurgia d’urgenza o per una eutanasia se questa opzione non è disponibile; il riscontro di alterazioni macroscopiche evidenti rende obbligatoria l’esecuzione di approfondimenti.

Proteine totali: devono essere molto inferiori rispetto al livello ematico e comunque inferiori a 2,5 g/dl. Se utilizziamo un refrattometro, si preferisce utilizzare siero perché un eccesso di EDTA – che potrebbe capitare se la provetta non viene riempita correttamente – renderebbe spurio il risultato.

Valori di proteine totali elevati indicano essudato, correlato a peritonite settica oppure ad una torsione, specialmente se a carico del piccolo intestino.

pH: il range di normalità è intorno a 7. Si abbassa notevolmente in corso di peritonite settica e in caso di acidosi sistemica grave.

Lattati: il livello “di guardia” per il liquido peritoneale è 1 mmol/l. Oltretutto questo valore si alza precocemente in caso di torsione o ischemia viscerale, rispetto al corrispondente valore ematico, permettendo un più rapido intervento operatorio. Il rapporto tra lattati peritoneali e lattati ematici deve essere < 1.

Glucosio: il range di normalità segue la glicemia ematica. Livelli di glucosio bassi indicano proliferazione batterica (peritonite settica).

Citologia del liquido peritoneale: nelle patologie strangolanti acute possiamo avere travaso di eritrociti e cellule della serie bianca con deviazione tossica, a causa della pressione idrostatica aumentata nel sito di torsione. In caso di peritonite settica, la conta cellulare è molto aumentata in valore assoluto con predominanza di neutrofili e pochi eritrociti. Possono essere visualizzati anche alcuni corpi batterici. In questi casi possiamo allestire un esame batteriologico dal liquido stesso (tramite tampone con medium o immettendone una piccola quantità in un terreno da emocoltura), indispensabile per una terapia antibiotica mirata ed efficace.

Dott.ssa Susanna Mereghetti