Vi sono alcune malattie genetiche specifiche di razza, tutte di carattere autosomico recessivo. Per l’allevatore questo implica la necessità di testare i riproduttori a rischio per evitare una progenie di omozigoti malati. Vediamo in dettaglio quali sono queste malattie.

Razza purosangue arabo

Abiotrofia cerebellare: AC

Si tratta di una grave patologia  neurologica causata da un’alterazione delle cellule del Purkinje presenti nel cervelletto. Il puledro affetto, intorno ai 2-4 mesi di vita, mostra tremori, atassia e decubito. I soggetti colpiti in modo grave spesso vengono sottoposti ad eutanasia per inabilità alla stazione, mentre sono possibili leggeri deficit di coordinazione ed andatura rigida nelle forme lievi, che tuttavia rendono impossibile e pericoloso un uso sportivo del cavallo colpito. L’eventuale esame istologico post-mortem del tessuto cerebellare malato mostra molto chiaramente una diminuzione della presenza di cellule del Purkinje con alterazione del tessuto granulare ad esse associato. Le poche cellule rimaste appaiono piccole e di morfologia modificata. Una diagnosi in vivo risulta pertanto possibile solamente con il test genetico.

Lavender Foal Syndrome: LFS

Anche in questo caso si tratta di una patologia neurologica che si manifesta alla nascita con una diluizione della colorazione del mantello molto caratteristica: uniformemente rosa chiaro o porpora. All’anomalia di pigmentazione sono associati molti deficit neurologici come: nistagmo o strabismo, movimenti simil epilettici (pedalamento, iperestesia, inabilità alla stazione anche solo sternale), atteggiamento stuporoso, opistotono, cecità. I soggetti colpiti non sopravvivono. Non è inoltre possibile identificare alcuna alterazione istologica post-mortem saliente a carico del sistema nervoso.   Anche in questo caso la conferma diagnostica avviene dunque tramite esame genetico.

Immunodeficienza severa combinata: SCID

L’anomalia genetica causa di questa malattia provoca l’alterazione di una protein-kinasi che codifica per un tratto di DNA necessario per la differenziazione dei linfociti T e B, che rimangono perciò indifferenziati, provocando una severa forma di immunodeficienza. I soggetti colpiti infatti mancano sia di linfociti T che B che di immunoglobuline e mostrano una grave ipoplasia di linfonodi e timo, mentre le cellule Natural killer sono presenti. Quindi una diagnosi di sospetto è possibile se riscontriamo con un esame clinico / ematologico: grave leucopenia, assenza di IgM (elettroforesi), infezioni ricorrenti. All’esame post- mortem si riscontra generalmente una grave ipoplasia di timo e linfonodi. La diagnostica di certezza si ha ancora una volta solamente con il test genetico.

Razza da sella

Sindrome del puledro fragile a sangue caldo: WFFS

Si tratta dell’alterazione di un gene che codifica per una lysil-idrossilasi indispensabile per una corretta sintesi del collagene e di altre proteine che costituiscono il tessuto connettivo, che risulta pertanto difettoso. I puledri colpiti mostrano un’esagerata fragilità della cute con comparsa di ulcere, ragadi e piaghe cutanee ricorrenti, specialmente in corrispondenza dei punti di pressione. Possiamo avere afte e lesioni anche a carico della mucosa orale ed esagerata lassità di tendini ed articolazioni. Si tratta di una sindrome incompatibile con la vita, i soggetti non riescono a deambulare e soffrono di dolori articolari ed infezioni multiple ricorrenti non responsive ai trattamenti. Anche in questo caso una corretta diagnosi e prevenzione attraverso l’esecuzione di test genetici risulta indispensabile.

Razze pony – “miniature horses”

Foal Immunodeficiency Syndrome: FIS

Questa forma di immunodeficienza, spesso associata ad anemia, si rende  manifesta  intorno alle 2-3 settimane di vita del puledro. Si tratta di un’anomalia che interessa un gene che condiziona gravemente la funzionalità di tutto il tessuto linfoide. I soggetti colpiti presentano quindi gravi infezioni ricorrenti non responsive alle terapie. La sintomatologia è molto variabile:  debolezza, diarrea, scolo nasale, broncopolmoniti, crescita stentata. Non vi è terapia, i puledri muoiono di setticemia o vengono soppressi.

Sindrome della separazione della parete dello zoccolo: HWSD

Si tratta di un difetto genetico che comporta la crescita di una parete dello zoccolo molto fragile, soggetta a rotture e setole pur con un aspetto della muraglia e del cercine coronario nella norma. I soggetti colpiti che manifestano questa alterazione soffrono di gravi zoppie e laminiti potenzialmente incompatibili con la vita in quanto croniche e ricorrenti. Sono descritti in letteratura soggetti omozigoti per questa alterazione che non manifestano questa malattia, quindi si suppone una penetranza non completa per questo difetto.

Miotonia congenita del New Forest Pony

E’ una malattia ereditaria che colpisce un gene codificante i canali del cloro della giunzione neuromuscolare della muscolatura scheletrica. Questo comporta una difficoltà di rilassamento delle fibre dopo stimolazione con vari gradi di manifestazioni cliniche: dalla semplice rigidità con tremori e debolezza fino al decubito permanente. I sintomi tendono a peggiorare nel tempo, anche se nelle forme più lievi il soggetto può condurre una vita quasi normale seppur senza alcuna possibilità di utilizzo sportivo.

Razze pesanti

Nanismo (Frisone)

I soggetti colpiti dalla mutazione del gene sul cromosoma 14, che è stato identificato in alcune linee di sangue di stalloni Frisoni, presentano anche una certa lassità dei legamenti e un’anomalia delle costole che ne condizionano gravemente la morfologia.

Epidermolisi bollosa : H-JEB (Belga sangue freddo)

Si tratta di una patologia genetica che determina la produzione di tessuto connettivo difettoso, similmente a quello che succede per la “Sindrome del puledro fragile a sangue caldo – WFFS”, con la differenza che in questo caso la mutazione che interessa il gene che produce parte della proteina Laminin 5 è situata in una parte differente del gene stesso, quindi il test è strettamente specifico di razza. La sintomatologia comprende gravi lesioni e perdita della cute con piaghe soprattutto a carico di arti, ano e genitali esterni. Può venire colpito anche il cercine coronario, provocando la perdita dello zoccolo. Possiamo inoltre riscontrare ulcere a carico di lingua, gengive e palato ed anomalie dello smalto e dell’eruzione dei denti, con conseguente impossibilità ad alimentarsi correttamente. La malattia porta a morte in poche settimane.

Colori del mantello, iperpigmentazione

E’ possibile richiedere un test genetico anche per la valutazione del colore del mantello trasmesso dal riproduttore, utile per alcuni standard di razza che prediligono o non accettano determinati pattern del mantello o l’iperpigmentazione.

Identificazione genetica e profilo parentale

Laboklin utilizza alcuni markers del DNA riconosciuti a livello internazionale (denominati microsatelliti) che differiscono per la lunghezza e che permettono con certezza l’identificazione del singolo individuo (polimorfismo di lunghezza). E’ possibile inoltre stoccare il DNA dei soggetti testati ed utilizzarlo per stabilire una parentela certa nella progenie.

Nella specie equina sono descritte numerose malattie a carattere genetico per le quali fino a pochi anni fa non era disponibile nessun test diagnostico appropriato. L’affinazione ed evoluzione odierna delle tecniche di mappatura cromosomica ha permesso l’identificazione di nuovi geni responsabili per le malattie ereditarie. Questo ha reso accessibili al clinico ippiatra molti test genetici a costi contenuti permettendo la diagnostica di certezza di numerose gravi malattie.

Ogni equino possiede un corredo genetico unico e specifico, di origine parentale, organizzato in 32 coppie di cromosomi (il cromosoma è una molecola di DNA che codifica per una serie di proteine specifiche) che si dividono solo al momento della formazione dei gameti (maschili o femminili). Ogni cromosoma porta una coppia di geni (cioè una porzione di genoma) che codifica per un determinato carattere, ogni gene ha un suo “locus” ovvero occupa una particolare posizione all’interno del cromosoma. Ciascun gene può differire dall’altro nelle informazioni relative a quel carattere,  le diverse varianti molecolari di uno stesso gene sono dette “alleli”. Questi modulano l’espressione del carattere codificato.

Le mutazioni di un allele possono essere recessive o dominanti:

• si manifestano fenotipicamente solo se presenti in entrambe le coppie alleliche nel caso di carattere autosomico recessivo
• si manifestano anche se presenti in un solo allele che compone la coppia nel caso di carattere autosomico dominante

I soggetti presi in esame vengono quindi classificati in omozigoti per quella data mutazione se hanno entrambi gli alleli che codificano per quel carattere mutati, oppure eterozigoti se invece presentano un solo allele alterato.

Seguendo questi parametri quindi possiamo avere:

• N/N: omozigote sano, non presenta la mutazione ricercata in entrambi gli alleli
• E/N: eterozigote, generalmente portatore sano o affetto in forma lieve
• E/E: omozigote malato, presenta la mutazione ricercata in entrambi gli alleli

Seguendo questo schema, gli allevatori possono pianificare gli incroci in maniera da dar vita a puledri che non manifestino malattie a carattere genetico evitando di incrociare tra loro soggetti eterozigoti / portatori i quali fenotipicamente non mostrano la patologia ma possono dare una progenie di omozigoti malati.

l materiali richiesti per l’esecuzione di questi test sono il sangue intero in EDTA oppure almeno 20-30 crini con il bulbo, dai quali vengono estratti i DNA, identificate le serie genomiche di interesse e confrontati gli alleli responsabili di malattia.

Vediamo quindi in dettaglio quali sono le principali malattie di carattere genetico che possiamo riscontrare nella specie equina.

Malattie comuni a tutte le razze

Ipertermia maligna equina: EMH

Si tratta di una disfunzione genetica che compromette l’attività del canale del rilascio dello ione calcio – denominato RyR1 – all’interno del reticolo sarcoplasmatico della muscolatura striata scheletrica che, comportando un eccessivo rilascio di questo ione in risposta alla somministrazione di farmaci od anestetici, determina una grave ipereccitabilità del muscolo stesso, causa di uno stato ipermetabolico con morte cellulare finale.

La sintomatologia clinica comprende ipertermia, fascicolazioni, tachicardia, rabdomiolisi, acidosi metabolicorespiratoria e morte per gravi disordini elettrolitici.

Il gene responsabile è autosomico dominante, il quadro clinico appare maggiormente severo nei Quarter Horse.

Miopatia tipo I da accumulo di polisaccaridi: PSSM

L’alterazione genetica provoca un’abnorme accumulo di glicogeno e polisaccaridi all’interno del tessuto muscolare. Questo eccesso provoca un’esagerata produzione di acido lattico durante la contrazione muscolare per effetto della glicolisi anaerobica con conseguente rigidità muscolare, acidosi, rabdomiolisi e mioglobinuria nei casi gravi oppure calo della performance con debolezza muscolare e sudorazione profusa. Le manifestazioni cliniche si hanno di solito all’inizio del lavoro, anche se leggero, in alcuni casi anche a riposo.

E’ una patologia autosomica dominante, con manifestazioni cliniche lievi in caso di presenza di un unico allele (eterozigosi per il gene malato).

Esiste una linea di sangue di Quarter Horse, Paint ed Appaloosa con prevalenza di questa malattia ma anche Purosangue e razze pesanti possono esserne colpite.

Idrocefalo

E’ una grave anomalia dello sviluppo che determina la nascita di puledri disvitali che muoiono subito dopo il parto, oppure aborti con distocia dovuta alla malformazione del feto.

Attraverso l’analisi delle linee di sangue che presentavano con maggiore frequenza la patologia si è arrivati ad identificare l’alterazione genetica (scambio di un nucleotide da “C” a “T” nel genoma) responsabile della malattia, così da permettere all’allevatore di effettuare degli incroci a basso rischio.

Epidermolisi bollosa: H-JEB

Si tratta di una malattia che causa vescicolazione della cute e delle mucose orali nei punti di applicazione delle pressioni, con perdita dello zoccolo per distacco della benda perioplica, tipicamente nei primi giorni dopo la nascita del puledro. A causa di queste manifestazioni cliniche si è costretti ad effettuare un’eutanasia per impossibilità del puledro alla deambulazione e per la comparsa di gravi infezioni in corrispondenza delle lesioni.

L’alterazione responsabile è una subunità del gene “5 Laminin”, che impedisce la produzione di un polipeptide della lamina dello zoccolo, la stessa che fissa l’epidermide al derma.

Malattie tipiche delle razze americane

Quarter Horse / Paint / Appaloosa

Paralisi periodica iperkaliemica: HYPP

La malattia è trasmessa da una mutazione autosomica dominante di un gene che codifica per una subunità del canale del sodio nel miocita, trasmessa da una specifica linea di sangue Quarter Horse poi diffusasi anche ad altre razze.

Questa anomalia determina di riflesso un eccesso di potassio nella cellula muscolare compromettendone l’attività contrattile. Possiamo avere una forma lieve di questa patologia con tremori, fascicolazioni, rigidità e debolezza muscolare oppure una forma precoce più grave, generalmente associata ad omozigosi, che si manifesta nel puledro. Nelle forme lievi, che compromettono l’utilizzo sportivo del soggetto, è possibile una terapia farmacologica durante gli episodi ed una dieta di mantenimento.

Deficienza dell’enzima della ramificazione del glicogeno: GBED

I puledri colpiti da questa anomalia enzimatica mancano dell’enzima che forma il glicogeno, quindi non riescono ad immagazzinare gli zuccheri nella forma ramificata. Possiamo avere aborti tardivi o nascita di puledri disvitali, deboli, incapaci di mantenere la stazione e di termoregolarsi, che muoiono poco dopo la nascita. sviluppando convulsioni.

Astenia dermale regionale ereditaria: HERDA (Hyperelastosis cutis)

I soggetti colpiti presentano l’anomalia di un gene autosomico recessivo che codifica per la sintesi del collagene, con perdita di adesività degli strati profondi della cute, iperelastosi ed estrema facilità nella formazione di pliche.

Di solito questo causa problemi nella zona della sella e dei finimenti, con dermatiti e fiaccature ricorrenti e formazione  di seromi.

Lethal White Foal Syndrome: OLWS

Si manifesta con omozigosi per il gene “Overo”, il puledro appare fenotipicamente bianco con occhi azzurri. Purtroppo questa anomalia del mantello si accompagna ad un’agangliosi dell’ultimo tratto dell’intestino con conseguente morte per blocco funzionale di tutto il tratto gastroenterico.

Con eterozigosi non abbiamo malattia, possiamo invece avere mantello con vari gradi e localizzazioni di bianco.

Sindrome da Insensibilità agli androgeni: AIS (64 XY – Femminizzazione testicolare)

E’ un’alterazione autosomica recessiva del gene che codifica per i recettori degli androgeni sul cromosoma X del soggetto malato. Non si tratta di un’anomalia dei cromosomi sessuali poiché il cariotipo è quello di un normale maschio XY, dove però la disfunzione recettoriale ha determinato un’alterata risposta dei tessuti fetali agli androgeni, con anomalie degli organi sessuali e manifestazioni variabili dopo la nascita del soggetto che si presenta fenotipicamente di sesso femminile.

Possiamo avere infatti dei genitali femminili esterni normali con mancanza/ipoplasia di utero e cervice, presenza di testicolo/i nel canale inguinale o addome secernenti testosterone che determina il comportamento mascolino in un soggetto che appare di sesso femminile.

Il gene autosomico recessivo alterato si trova sul cromosoma X con trasmissione della malattia per via materna.

Speed-Gene: MSTN

Il gene oggetto di esame è quello coinvolto nella sintesi della miostatina, una proteina che controlla la produzione di cellule muscolari.

Esistono tre differenti varianti alleliche di questo gene:

• T/T: i soggetti con questa tipologia sviluppano masse muscolari tardivamente, sono più adatti alle competizioni sulla lunga distanza
• C/C: i soggetti con questa tipologia sviluppano invece masse muscolari più precocemente, sono più adatti alle competizioni che richiedono sforzi brevi ed intensi
• C/T: questi soggetti sono adatti a competizioni su distanze medie

Non si tratta di una vera e propria patologia, piuttosto identifica una predisposizione del soggetto preso in esame verso una determinata performance sportiva.

Questi test possono essere effettuati singolarmente oppure si possono trovare raggruppati in “Pacchetti” particolarmente convenienti dedicati per le diverse razze.

Nel prossimo approfondimento prenderemo in esame le malattie tipiche di Purosangue, Pony, razze pesanti, lo screening parentale ed i colori del mantello.

Nella clinica ippiatrica le patologie muscolari e cardiache contribuiscono in maniera sostanziale alla „Sindrome da calo di performance“ del cavallo sportivo.

Accanto ad un’approfondita visita clinica che comprenda una valutazione delle andature con esclusione di zoppie con algia di natura scheletrica, patologie respiratorie di origine allergico-infettiva o deficit di origine neurologica, che hanno come conseguenza una compromissione delle performance sportive, rimane come ultima opzione un esame approfondito dell‘apparato muscolare e cardiaco, con l‘ausilio indispensabile del laboratorio e di test funzionali appropriati, in particolare:

• esame emocromocitometrico completo: importante per valutare un’anemia con successiva perdita di efficienza muscolare per scarsa capacità di trasporto dell’ossigeno o una patologia infettiva con aumento delle cellule della serie bianca
• marker infiammatori: fibrinogeno ed amiloide sierica, importanti per escludere la presenza di infiammazione che suggerisce la presenza di una miosite / endocardite o pericardite infiammatoria od infettiva
• esame biochimico: i principali enzimi muscolari, misurabili preferibilmente su siero, che devono essere presi in considerazione sono:
• creatin chinasi (CK): enzima specifico della muscolatura  scheletrica  e cardiaca che permette al miocita di disporre dell’ATP necessario per la contrazione del muscolo. Si innalza nel siero o nel plasma piuttosto rapidamente (tra le 6/12 ore dopo il danno) e tende a ritornare a livelli nella norma nell‘arco di 1-3 giorni. Si rileva generalmente in circolo in caso di danno delle cellule muscolari sia cardiache che scheletriche, in modo lieve in caso di trasporti, stress da eccessivo allenamento o sforzo sportivo, in maniera molto più importante (con rialzo dei valori oltre i 1000 UI/l) in caso di patologia (infettiva, carenziale, metabolica, traumatica) che coinvolge massicciamente il miocita.
• aspartato aminotrasferasi (AST): enzima presente negli epatociti ed eritrociti, oltre che nei Per questo motivo non è considerato un indicatore specifico di patologia muscolare ma va interpretato in associazione ad altri parametri organo-specifici. Questo enzima si innalza nelle 24–48 ore dall’insulto muscolare ed i suoi livelli permangono elevati per 7-8 giorni. La misurazione seriale quindi di CK congiuntamente ad AST permette di stabilire la tempistica del danno dei miociti (la CK si alza prima ma si abbassa subito, la AST si alza successivamente ma rimane alta per più giorni: alti livelli quindi di AST e CK rientrata indicano che il danno muscolare si è risolto, mentre livelli elevati di AST unitamente a CK indicano più lesioni acute ripetute nel tempo ancora presenti).
• lattato deidrogenasi (LDH): enzima non organo specifico che completa la glicolisi anaerobica presente in muscoli, fegato, reni, muscolatura I livelli sierici aumentano dopo 24 ore dal danno cellulare e permangono tali fino a 7 giorni. È è possibile la sua differenziazione nei vari isoenzimi, alcuni più specificatamente muscolari oppure la misurazione di un enzima come l‘isomero alpha-HBDH, specifico della muscolatura cardiaca, che permane elevato per molti giorni in caso di infarto del miocardio o forte emolisi (anche gli eritrociti ne sono ricchi).
• troponina I: le troponine sono proteine che regolano la contrazione della muscolatura cardiaca e striata, esistono differenti isomeri specifici cardiaci e sono utilizzati per questo motivo per valutarne la funzionalità. I suoi livelli si innalzano rapidamente e permangono elevati per 1–2 giorni.
• PO4: esprime il livello di fosforo legato all‘ossigeno in In condizioni di omeostasi metabolica con corretto assorbimento attraverso una dieta equilibrata ed una fisiologica escrezione renale, un innalzamento di questo valore indica un severo danno della muscolatura striata per trauma o neoplasia.
• elettroliti sierici: permettono di differenziare la presenza di aritmie da alterazione dell’equilibrio elettrolitico in presenza di patologia dell’emuntorio (ipo-iperpotassiemia ed ipomagnesiemia soprattutto) dai disturbi funzionali primari di miocardio/muscoli.

Per tutti questi parametri bisogna considerare che un danno degli eritrociti con emolisi (dovuta a prelievi ripetuti o troppo rapidi, ad un danneggiamento dell’endotelio vasale o ancora ad una modalità di conservazione del campione non idonea con ritardata separazione dalla parte corpuscolata e/o mantenimento del campione ad una temperatura non refrigerata per più di 3–4 giorni) può causare un innalzamento dei valori spuri anche molto importante. Per quanto riguarda gli elettroliti invece, alcuni tendono ad aumentare (per es. il K) mentre altri a diminuire; a queste condizioni comunque non sono considerati attendibili.

Accanto a questi enzimi prettamente di origine muscolare possiamo affiancare alcuni parametri di valutazione del metabolismo per escludere sindromi carenziali importanti:

• BUN, creatinina e lattati: la valutazione della condizione metabolica del soggetto (attraverso i lattati) e della funzionalità renale è indispensabile per una diagnostica mirata del distretto muscolare o Le anomalie di questi organi potrebbero essere secondarie a gravi patologie sistemiche. Per la misurazione dei lattati si raccomanda l’uso delle provette con NaF oppure l’invio di siero refrigerato, separato rapidamente dopo il prelievo.
• vitamina E e selenio: la carenza di questi elementi è causa di un tipo di miopatia nutrizionale grave.
• esame delle urine: la presenza di mioglobina, una proteina muscolare che viene molto rapidamente liberata in circolo (dai 5 ai 30 minuti dopo il danno muscolare) e velocemente filtrata dal rene, ritrovandosi quindi nelle urine (che assumono il caratteristico aspetto  brunorossastro „Coca-cola“), è un indice sicuro di grave e massiccia sofferenza muscolare con compromissione metabolica importante che richiede una pronta ed aggressiva terapia (fluidi, FANS, Vitamina E e Selenio, Carnitina, …). Un esame approfondito delle urine è necessario per differenziare la presenza di mioglobina, emoglobina od emazie, che possono causare una colorazione similmente anomala.

Sono disponibili infine una serie di esami di approfondimento quando abbiamo la certezza che siano compromessi la muscolatura striata / il distretto cardiaco:

• biopsia muscolare: permette di differenziare, tramite un esame istologico della fibra muscolare, dei vasi e delle giunzioni neuromuscolari, alcune patologie su base anatomica rispetto a patologie di differente I campioni ottenuti per via bioptica (sono da preferire i muscoli glutei od il semitendinoso) possono essere inviati al Laboratorio immersi in formalina al 5%.
• test genetici: sono disponibili numerosi test genetici per escludere tutta una serie di miopatie a carattere famigliare:

Miotonia congenita, Paralisi periodica iperkaliemica (HYPP), Miopatia I da accumulo di polisaccaridi (PSSM), Ipertermia maligna (EMH), Deficienza dell‘enzima per la ramificazione del glicogeno (GBED).

Per effettuare questi test sono sufficienti 1 ml di sangue in EDTA oppure almeno 30 crini (strappati, perché siano provvisti del bulbo).

• citologia e coltura dei liquidi pleuro-pericardici: recuperabili per via ecoguidata con ecografia cardiopolmonare. Possiamo valutare proteine totali, peso specifico, pH, conta e valutazione cellulare, prova di Rivalta, colesterolo, trigliceridi, LDH e glucosio.
• elettrocardiografia / elettromiografia: indispensabili per una valutazione funzionale delle fibre muscolari e delle giunzioni neuromuscolari.

Contesto clinico

Nell’allevamento professionare del cavallo così come nell’allevamento amatoriale, l’esame della salute riproduttiva delle cavalle ha un ruolo fondamentale.

In particolare, per le cavalle con noti disturbi dela riproduzione, ottenere un quadro diagnostico completo è utile per una valutazione realistica del potenziale successo dell’allevamento.

Inoltre, p.es. nel caso di embriotransfer, solo le cavalle sane dal punto di vista riproduttivo possono essere dotate di un ambiente uterino adeguato per il concepimento.

La valutazione degli esiti rilevanti per la fertilità viene sempre effettuata nell’ambito di una analisi generale clinico-ginecologica e viene eventualmente integrata da esami batteriologici, endocrinologici e istopatologici. Va segnalato che, anche se singoli risultati possono fornire importanti indicazioni sulle possibili ginecopatie, è possibile stabilire una prognosi affidabile di fertilità solo sommando i diversi esiti dell’esame generale. Informazioni importanti a livello anamnestico comprendono informazioni generali (p.es. età, utilizzo dell’animale) e  dettagliate (p.es. vergine, multipara, vuota, numero dei parti portati a termine, infestazioni, andamento del ciclo) sulla cavalla.

L’esame clinico-ginecologico comprende l’esame dei genitali esterni ed interni per mezzo di ispezione, palpazione, ecografia ed  endoscopia. Le alterazioni dei genitali esterni comprendono per esempio cambiamenti di disposizione delle labbra (chiusura difettosa della vulva) che possono favorire infiammazioni. Nelle cavalle con pneumo- o urovagina spesso è presente una vaginite cronica o cervicite che puó essere causa di una ridotta fertilità.

L’esame ginecologico interno comprende p.es. i rapporti di grandezza, la simmetria di utero e ovaie così come la struttura ed il contenuto dell’utero.

L’esame è utile tra l’altro per la determinazione del momento del ciclo come anche per la diagnosi di presenza di neoformazioni ovariche – potenzialmente attive dal punto di vista endocrino.

Nel caso della diagnosi di megaovario le cause principali da considerare sono tumori e follicoli anovulatori persistenti. I tumori delle cellule della granulosa rappresentano il tumore ovarico più comune nella cavalla. Significativa è la potenziale attività endocrina delle cellule della granulosa, spesso associata a elevati livelli di AMH nel siero.

Accanto alla classica sindrome colica di varia origine e tipologia, nel cavallo possiamo riscontrare una serie di patologie enteriche acute/croniche per le quali la diagnostica di laboratorio appare di primaria importanza.

La sintomatologia di questo tipo di malattie è infatti molto aspecifica: diarrea acuta/cronica o semplicemente feci poco formate, perdita di peso, disoressia od anoressia, ma anche appetito nella norma, edema degli arti da ipoproteinemia, febbre ricorrente, endotossiemia, disidratazione.

Spesso la terapia è unicamente di supporto con antidiarroici orali, fluidi, regolatori della motilità, elettroliti, ma una precisa diagnosi è fondamentale per una corretta prognosi a lungo termine del soggetto malato.

Vediamo ora in dettaglio quali patologie intestinali possiamo riconoscere con frequenza maggiore nella pratica clinica:

• Malattia infiammatoria intestinale cronica (CIBD)
• Enterocoliti acute
• Diarrea idiopatica cronica
• Linfoma alimentare
• Peritonite
• Ascessi addominali

Nell‘anamnesi di queste patologie ricordiamo un‘età oltre i 10 -15 anni, l‘occorrenza episodica in una popolazione di soggetti (mentre le enteriti batteriche o le virosi tendono a verificarsi in più casi) e la durata generalmente cronica e debilitante (tranne per le enteriti/enterocoliti che possono avere decorso iperacuto e portare rapidamente a morte per enterotossiemia e disidratazione).

Numerose sono le complicanze associate a questi disordini: laminiti, anemia, edemi degli arti o delle parti declivi, sofferenza renale conseguente alla tossicosi e disidratazione.

Malattia infiammatoria intestinale cronica (CIBD)

Vedi „Sindrome degenerativa enterica geriatrica“ in “Il cavallo anziano” (approfondimento settembre 2016)

Enterocoliti acute

Si tratta di malattie infiammatorie che interessano la mucosa del tratto intestinale, sono caratterizzate da rapida insorgenza e sviluppo, hanno come sintomo principale la diarrea, spesso profusa ed acquosa, e la grave compromissione generale. In questi casi bisogna intervenire tempestivamente a supporto del bilancio elettrolitico e della perdita di liquidi per evitare disidratazione, intossicazione, blocco renale e shock settico.

• Esame emocromocitometrico: di solito abbiamo leucopenia e trombocitopenia con aumento dell‘ematocrito (Ht) per effetto della disidratazione, fibrinogeno ed amiloide sierica elevati
• Parametri biochimici: possiamo avere inizialmente un aumento delle proteine totali per effetto della disidratazione, seguito poi da ipoproteinemia, importanti alterazioni del profilo elettrolitico con ipoNa, ipoK, ipoCl, creatinina ed azotemia elevate nelle fasi avanzate, lattati aumentati (acidosi metabolica).

Questi parametri biochimici subiscono rapide variazioni in corso di diarrea acuta, quindi sono molto utili in misurazione seriale per monitorare le condizioni metaboliche del paziente, in modo da intervenire tempestivamente con aggiustamenti terapeutici senza aspettare il peggioramento clinico.

Per la diagnostica eziologica disponiamo di un‘ampia categoria di esami effettuabili su materiale fecale:

• Batteriologia per batteri patogeni
• Micologia
• Ricerca di enterotossine da Clostridium
• Ricerca tramite PCR per: Coronavirus, Rotavirus, Rhodococcus, Lawsonia intracellularis (puledri), Salmonella
• Ricerca parassiti e protozoi

Da sottolineare che molto spesso non si arriva a riconoscere un‘eziologia definita. Sono descritte infatti molte forme di enterocolite causate da farmaci (antibiotici o FANS), di origine alimentare (da alimenti o acqua contaminati o „a frigore“), ed anche una „Colite X“ di origine sconosciuta.

Diarrea idiopatica cronica

Si tratta di episodi diarroici ricorrenti di origine sconosciuta, spesso causati da dismicrobismi con fermentazioni anomale e correlati disturbi del transito, da sequele di errori alimentari o da pregresse infezioni e/o endoparassitosi trascurate.

Sono di solito colpiti soggetti giovani, non sempre si arriva ad una diagnosi di certezza, più spesso si procede per esclusione di altre patologie (parassitosi, CIBD, linfoma alimentare, patologie epatiche e gastriche, …).

Gli esami ematologici e fecali sono spesso nella norma. In riferimento all‘esame parassitologico, si consiglia un esame quantitativo con metodica McMaster che permette di quantizzare il carico parassitario di questi soggetti particolarmente sensibili.

La terapia è perlopiù alimentare ed orale, con utilizzo di preprobiotici e regolatori della motilità, dieta frazionata in piccoli pasti con fibra corta e cereali trattati termicamente per favorirne l‘assimilazione riducendo le fermentazioni.

Linfoma alimentare

Questa neoplasia colpisce prevalentemente soggetti adulti, ha insorgenza e decorso subdoli con sintomi aspecifici: perdita di peso, lievi coliche ricorrenti, episodi diarroici, edemi, rialzi termici, malassorbimento ed enteropatia protidodisperdente. Si tratta di un‘infiltrazione neoplastica diffusa della parete intestinale a decorso cronico, che determina una progressiva perdita della funzionalità della mucosa e successive alterazioni funzionali responsabili della sindrome clinica associata.

• Esame emocromocitometrico: possiamo avere in alcuni casi, ma non sempre, una leucocitosi neutrofila con alterazioni morfologiche della linea bianca visibili allo striscio, anemia, aumento di fibrinogeno ed amiloide sierica
• Parametri biochimici: di solito si rilevano ipoproteinemia, ipoalbuminemia, iperglobulinemia, aumento di ALP, ipercalcemia
• Elettroforesi delle proteine sieriche: permette di differenziare le proteine totali in albumine, globuline e le frazioni alpha, beta, gamma, le proteine di fase acuta come l‘amiloide sierica e le immunoglobuline. Il profilo elettroforetico di queste frazioni permette una maggior precisione diagnostica in caso di patologie enteriche gravi con malassorbimento.

Purtroppo la diagnosi di certezza si ha solamente post mortem, all‘ispezione visiva ed all‘esame istologico delle parti infiltrate presenti nel pacchetto intestinale. Una possibilità potrebbe essere un esame istologico da biopsia laparoscopica (poco attuabile nella comune pratica clinica) oppure da biopsia rettale, dove però sono frequenti i campionamenti di parti di mucosa non diagnostici.

• Citologia ecoguidata da liquido peritoneale: un attento esame ecografico potrebbe essere un valido aiuto nella rilevazione delle anomalie della parete intestinale, in quanto l‘ ispessimento della mucosa, l‘aumento del volume dei linfonodi mesenterici, l‘infiltrazione di fegato, milza e reni operata dal tessuto neoplastico risultano visibile ecograficamente. L‘esame citologico del liquido peritoneale potrebbe rilevare la presenza di cellule neoplastiche, anche se un esito negativo non permetterebbe di escludere la patologia.

Peritonite

Si tratta di un‘infiammazione della sierosa che avvolge il tratto intestinale, con aumento della produzione di fluido ed alterazione delle sue caratteristiche con deposizione di fibrina, iperemia, effusioni.

La peritonite può avere origine batterica, traumatica, neoplastica, parassitaria e può manifestarsi con colica, febbre, anoressia, diarrea sempre associata a forte dolorabilità, tachicardia, tachipnea, disidratazione e forti squilibri elettrolitici, perdita di proteine e fenomeni settico-necrotici intestinali con “ileo paralitico”, ischemia e riassorbimento di tossine dal lume dell‘organo.

• Esame del liquido peritoneale: un esame citologico e biochimico con valutazione di pH, proteine totali, peso specifico, prova di Rivalta, colesterolo, trigliceridi, glucosio e LDH, possono permettere di arrivare ad una diagnosi. Infatti, solitamente, in corso di peritonite, si riscontra un‘alterazione del colore e della torbidità del liquido peritoneale, un aumento deciso delle proteine totali e della conta delle cellule della serie bianca e la presenza di emazie e batteri (da striscio o coltura).
• Esame emocromocitometrico: possiamo avere sia leucocitosi che leucopenia nelle forme peracute gravi ed aumento dell‘ematocrito e dei marker infiammatori
• Parametri biochimici: possiamo avere ipoproteinemia ed eventuali alterazioni più gravi in caso di rottura viscerale e/o setticemia

Ascessi addominali

Si tratta di patologie spesso conseguenti a precedenti infezioni delle vie respiratorie, dell‘ombelico nei puledri o dovute a corpi estranei.

Gli agenti eziologici possono essere molteplici. Frequenti sono: Streptococcus sp., Escherichia coli, Salmonella e nei puledri Rhodococcus.

Si rilevano frequentemente coliche ricorrenti, perdita di peso con o senza disturbi dell‘appetito, febbre e diarrea intermittente, decadimento generale della condizione corporea.

• Esame emocromocitometrico: frequenti leucocitosi neutrofila, anemia, aumento di fibrinogeno ed amiloide sierica
• Parametri biochimici: possono essere nella norma se la massa addominale non coinvolge alcun organo in particolare
• Esame citologico ecoguidato: una citologia / istologia transcutanea potrebbe permettere una diagnosi. È consigliabile effettuare questo esame per via ecografica in quanto, se non venisse raggiunta la formazione ascessuale, si potrebbero avere degli esiti non attendibili. Riuscendo a drenare l‘ascesso, l’esecuzione di un tampone batteriologico e/o micologico risulterebbe indispensabile per l’impostazione di una terapia idonea.

Le malattie epatiche possono avere carattere acuto o cronico e sono associate molto spesso ad una sintomatologia aspecifica: colica o dimagramento progressivo, anoressia o scarso appetito, diarrea o feci poco formate o viceversa troppo secche, ittero, anemia, disturbi coagulativi, disordini neurologici, lesioni cutanee.

Il fegato può rigenerarsi e la sintomatologia spesso compare quando ormai le capacità dell‘organo di compensare i deficit risultano compromesse (nel caso di patologie croniche ad andamento subdolo) e le possibilità di recupero sono ormai limitate. Un controllo sierologico degli enzimi epatici permette quindi di intervenire prima della comparsa di sintomi chiari della sofferenza dell’organo, ottimizzando il successo terapeutico.

La diagnostica di laboratorio costituisce un ausilio indispensabile per le malattie di questo distretto, possiamo infatti effettuare:

• un‘analisi degli enzimi epatici, associando anche un esame emocromocitometrico completo
• una diagnostica sierologica o PCR per malattie infettive e/o parassitarie che possono colpire questo organo
• una diagnostica citoistologica da biopsia o da agoaspirato ecoguidato del parenchima epatico.

Ematologia

• Esame emocromocitometrico: possiamo rilevare anemia da malassorbimento o disturbi coagulativi per le forme croniche, o ancora leucocitosi in caso di epatite acuta.
• Parametri biochimici: abbiamo molti parametri sierologici che possono aiutare nella comprensione della funzionalità Alcuni enzimi sono prodotti direttamente dall‘epatocita e vengono liberati in circolo in caso di danno di membrana di queste cellule, altri sono specifici delle vie biliari, altri ancora sono comuni a diversi organi e quindi meno precisamente diagnostici.

Maggiore è il numero delle cellule epatiche (del parenchima o delle vie biliari) coinvolte, maggiore sarà il tempo richiesto per il rientro nei limiti di normalità dei parametri ad esse correlati.

Questo permette di differenziare le patologie epatiche in acute e croniche, che interessano il parenchima o le vie biliari.

– Enzim epatocellulari: prodotti direttamente dall‘epatocita, i più specifici e precoci sono:

• glutammato deidrogenasi (GLDH): prodotta quasi esclusivamente dall‘epatocita, nella regione centro-lobulare; un suo innalzamento rispecchia quindi un grave danno cellulare. E‘ specifica e stabile nel siero.
• aspartato aminotransferasi (AST): non si tratta di un enzima specifico, è presente infatti anche nei miociti e negli eritrociti, quindi elevati livelli sierici di questo enzima possono riscontrarsi anche in caso di emolisi o patologie muscolari.

– Enzimi epatobiliari: il loro aumento in circolo rispecchia fondamentalmente una patologia caratterizzata da colestasi e danno alle vie biliari

• gamma-glutamiltransferasi (Ggt): si tratta di un enzima collegato alla membrana delle cellule delle vie biliari, presente anche nell‘epitelio dell‘intestino e pancreas. E‘ molto specifico ed indice  di patologia colestatica. È normalmente più elevato nei puledri rispetto ai soggetti adulti.
• fosfatasi alcalina (ALP): non si tratta di un enzima specifico del fegato, si riscontra anche nelle ossa, soprattutto dei giovani in crescita, dove un suo innalzamento è considerato fisiologico. Se si altera in parallelo ad un altro enzima epatico, possiamo supporre una colangite, una colestasi od una cirrosi biliare.

– Enzimi funzionali: rispecchiano la funzionalità epatica, intesi come escrezione (bilirubina ed acidi biliari) oppure sintesi (proteine, glucosio, globuline e fattori della coagulazione)

• bilirubina diretta/indiretta: abbiamo due forme di questo enzima, la forma indiretta (o non-coniugata) deriva direttamente dalla degradazione dell‘emoglobina degli eritrociti che hanno esaurito il loro ciclo vitale; viene successivamente prelevata dal circolo e trasformata dagli epatociti nella forma  diretta (o coniugata), pronta per essere escreta con la bile. Quando il livello sierico si innalza, differenziare le due forme permette di diagnosticare una malattia emolitica/anoressia (aumento della forma indiretta) da una patologia prettamente epatica con colestasi (aumento della forma diretta). Un eccesso di bilirubina nel sangue può dare ittero, prurito e dermatiti, nei puledri indica anche sepsi o patologia enterica (aumento della forma diretta), isoeritrolisi neonatale o anemia emolitica (aumento della forma indiretta).
• acidi biliari: compongono la bile e vengono riassorbiti nell‘intestino; il loro livello sierico rispecchia l‘efficienza del circolo entero-epatico, si innalzano prima della bilirubina in caso di patologia epatica e deficit di uptake dal circolo portale.
• albumina: è prodotta direttamente dagli epatociti; in caso di grave danno cronico possiamo avere ipo-albuminemia da calo di produzione oppure da perdita con le feci od urina in caso di gravi patologie enteriche o renali.
• globuline: aumentano in caso di infiammazioni croniche causando un‘ipo-albuminemia di riflesso; in caso di malattia epatica si innalzano soprattutto le alpha globuline. Possiamo differenziare tra alpha-, beta- e gamma-globuline tramite l’elettroforesi sierica.
• proteine totali: sono più spesso indice di malassorbimento quando basse o di sovraccarico alimentare/disidratazione od epatite acuta quando elevate.
• glucosio: con una patologia epatica potremmo avere difficoltà nel mantenere una glicemia stabile per ridotta gluconeogenesi, anche se non si tratta di un parametro patognomonico per questo organo.
• fattori della coagulazione: sono per la maggior parte prodotti dal fegato, quindi un grave  deficit degli  epatociti  comporta  anche  un  considerevole aumento del tempo di coagulazione (PT – APTT) con riduzione della produzione di  fibrinogeno.

Nel caso di grave cirrosi o di fibrosi, gli enzimi epatocellulari ed epatobiliari possono non apparire gravemente alterati mentre alcuni enzimi funzionali come bilirubina totale, acidi biliari, albumine e proteine possono risultare molto bassi; oppure, viceversa, possiamo rilevare elevati livelli di trigliceridi come effetto metabolico della mobilizzazione degli acidi grassi dal tessuto adiposo, successiva ad anoressia od a difficoltà nel mantenimento della glicemia per effetto del malassor-bimento. Questo elevato livello di trigliceridi nel sangue contribuisce a sovraffaticare maggiormente un fegato già compromesso, con deposizione di grasso negli epatociti (la cosiddetta steatosi epatica – vedi Aktuell „Iperlipidemia / iperlipemia negli equidi”).

Elettroforesi delle proteine

Si tratta di un esame che permette la differenziazione delle proteine sieriche in albumine, globuline (alpha-, beta-, gamma-globulina), aptoglobina, glicoproteine di fase acuta, per una maggiore precisione diagnostica in varie patologie infiammatorie, neoplastiche, metaboliche, immunitarie e parassitarie.

Può dare un‘ulteriore indicazione sulla funzionalità epatica, soprattutto in caso di patologia cronica.

Biopsia epatica

È possibile eseguirla per via ecoguidata, preferibilmente sul fianco destro, a livello del 12°-14° spazio intercostale con relativa facilità e minimi rischi, se non vi sono anomalie della coagulazione.

Un esame cito-istologico del tessuto prelevato permette di valutare la presenza di fibrosi e/o cellule cancerose, infiammatorie o degenerate.

Un esame ecografico del parenchima, dei vasi e dei dotti biliari permette di diagnosticare la presenza di ascessi, neoplasie, parassiti, colelitiasi, congestione e dilatazione vasale e costituisce un ausilio indispensabile per una corretta diagnosi clinica di questo organo.

Le malattie parassitarie interne negli equini interessano perlopiù l‘apparato gastroenterico e respiratorio e possono colpire soggetti di ogni età, con predilezione per gli yearlings ed i soggetti anziani oltre i 20 anni.

La sintomatologia è molto varia e sfumata: possiamo avere disoressia, anoressia, calo di peso, pelo opaco, episodi diarroici, enzimi epatici alterati od anemia, calo della performance e tosse secca recidivante, episodi colici o diarrea intermittente od anche assenza di sintomatologia clinica manifesta.

In passato le scuderie attuavano una generale profilassi antielmintica di branco, indifferenziata, circa 2 volte l‘anno, senza grossi approfondimenti riguardanti il tipo di parassiti presenti, l‘identificazione dei soggetti eliminatori vs resistenti all‘infestazione, la rotazione e l‘igiene dei pascoli, in quanto raramente si riscontravano episodi di farmacoresistenza. Oggi disponiamo di maggiori conoscenze per quanto riguarda il ciclo di sviluppo, il concetto di equilibrio ospite/parassita e la presenza di soggetti eliminatori rispetto ad altri che invece tollerano con minori effetti clinici la presenza di questi organismi e quindi necessitano di trattamenti meno frequenti.

Questo approccio risulta oltremodo indispensabile in quanto negli anni si sono purtroppo sviluppate delle resistenze verso le molecole normalmente utilizzate come  antielmintici, per questo motivo è d’obbligo un utilizzo responsabile di questi presidi farmacologici solo successivamente ad una precisa diagnostica. Vediamo come e per quali infestazioni la diagnostica di laboratorio può venire in nostro aiuto.

Esame delle feci:

conta delle uova / larve presenti

Si tratta dell‘esame visivo qualitativo standard di ricerca delle uova/larve di parassiti nematodi e coccidi nelle feci, usualmente eseguito tramite metodica di flottazione in soluzione sovrasatura, per sfruttare le differenze di peso specifico tra il materiale fecale e gli elementi parassitari e successivo controllo visivo tramite microscopio. Questo esame non permette di quantificare la presenza di cestodi, in quanto l‘escrezione di proglottidi e uova ha caratteristiche di intermittenza, indipendenti dal carico parassitario presente.

Si consiglia di prelevare le feci fresche o fissate in formalina (metodica SAF) preferibilmente dall‘ampolla rettale, per evitare contaminazioni telluriche e l’invio di feci troppo disidratate, quindi poco lavorabili e con parassiti morfologicamente modificati. Il campione raccolto può essere conservato 2-3 giorni a temperatura controllata.

L‘evoluzione di questo test è una metodica quali-quantitativa che permette di valutare la presenza di uova e larve, di considerarne la quantità e di valutarne la diminuzione post-trattamento, alla luce della presenza di fenomeni di antielmintico-resistenza: il test di riduzione della conta fecale (FECR), effettuato tramite metodica McMaster.

Esame McMaster modificato

Si tratta di una normale conta fecale su soluzione sovrasatura dove però si quantizza la presenza delle uova tramite l‘utilizzo di un‘apposita camera, composta da due vetrini delimitati in quadratini di dimensioni 1 cm x 1 cm x 1,5 mm di profondità, formanti un‘intercapedine di 0,15 ml per ogni quadratino presente in superficie. In questo modo risulta possibile calcolare la quantità di uova presenti per grammo di materiale fecale preso in esame, con una sensibilità a partire da 50 uova/gr di feci.

La soglia standard per decidere se sottoporre il soggetto preso in esame a trattamento antielmintico è fissata generalmente tra i 100 EpG/OpG od uovaoociti/gr., oppure possiamo valutare l‘efficacia del trattamento utilizzato valutando la riduzione della carica parassitaria (uova/oociti rilevati) pre e post-trattamento, con un intervallo di 10-14gg. In questo modo possiamo adattare il nostro protocollo antielmintico decidendo di trattare con maggiore frequenza i soggetti eliminatori (che non hanno quindi ottenuto un buon equilibrio ospite-parassita) e con minore frequenza quelli che invece, pur presenti nello stesso ambiente, hanno un buon controllo del loro carico parassitario (ricordiamo che nessun soggetto mai si sterilizza dai parassiti).

Con questo monitoraggio possiamo inoltre utilizzare meno  antielmintici, riducendone la dispersione ambientale e ritardando quanto più possibile l‘insorgenza di resistenze, dato che l‘industria farmaceutica non è in grado di fornirci molte molecole adatte a questo scopo e quelle in uso attualmente lo sono da almeno 10-20 anni.

Questo approccio permette inoltre di allungare gli intervalli rotazionali dei vari principi attivi presenti sul mercato fino a quando veramente la molecola che stiamo utilizzando non funziona proprio più nel mantenere la carica parassitaria ambientale sotto controllo nel nostro allevamento/scuderia e quindi un cambio appare giustificato, similmente a quello che già succede per un utilizzo responsabile degli antibiotici nel limitare l‘insorgenza delle resistenze batteriche.

Esame qualitativo mediante apparato di Baermann

Si tratta di una metodica che sfrutta le caratteristiche di mobilità particolari delle larve di Strongylus spp., Dictyocaulius arnfieldii che causano negli equidi la verminosi polmonare da larva migrans. Attraverso l‘utilizzo di questo apparato, le larve migrano all‘interno di una soluzione per sedimentazione dal materiale fecale e possono successivamente essere visualizzate su vetrino.

È possibile affiancare un esame citologico del “Broncho Alveolar Lavage” o BAL  a successiva conferma diagnostica di patologia parassitaria polmonare.

Ricerca antigenica (Ag):

Giardia, Cryptosporidium, Rhodococcus, Lawsonia

Grazie alle nuovissime tecniche immunoenzimatiche, per alcune specie la cui escrezione di uova non rispecchia la quantizzazione del carico parassitario (p.es. Coccidia spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp.), è possibile effettuare una ricerca antigenica mirata  nel materiale fecale. Rilevare l‘antigene del microrganismo che costituisce il sospetto diagnostico nel materiale fecale, similmente a quello che succede per la ricerca degli anticorpi nella diagnostica sierologica, permette un‘efficace diagnosi quando il semplice esame microscopico potrebbe non rilevare la presenza di pochi parassiti, in relazione all‘elevata mole di feci prodotta. La sonda che reagisce con il marcatore immunoenzimatico va a ricercare delle proteine di membrana presenti sul parassita, rintracciandole anche se gli organismi sono presenti in piccole quantità, ricerca difficilmente fattibile con il normale esame visivo su vetrino colorato.

Per i puledri possiamo effettuare una ricerca dell‘Ag per Lawsonia intracellularis che causa diarrea recidivante e Rhodococcus che usualmente si localizza in ambito polmonare ma a volte forma ascessi del tratto gastro-enterico causa di grave diarrea e dispersione del batterio con le feci. Entrambi questi agenti eziologici rispondono solamente a terapie mirate, quindi una diagnostica precisa è fondamentale nella risoluzione della patologia.

Ricerca anticorpale (Ac)

Sono possibili titolazioni anticorpali (Ac) tramite ELISA per Fasciola hepatica.

Esami ematologici

Di solito l‘ematologia non viene molto in aiuto per quanto concerne la diagnostica degli endoparassiti. Possiamo infatti avere alterazioni generiche  come  anemia, eosinofilia, alterazioni delle proteine totali con ipoalbuminemia ed iper-ß-globulinemia, alterazione degli enzimi epatici.

Nell‘ambito della diagnostica delle malattie infettive abbiamo a disposizione una metodica di ricerca ed amplificazione del materiale genetico relativo all‘agente eziologico causa di malattia: la PCR (Polymerase Chain Reaction).

Si tratta di una tecnica di amplificazione genica in vitro di specifiche sequenze di DNA, attraverso l‘utilizzo di polimerasi e primers di estensione, riferita al genoma di agenti eziologici responsabili di malattia, per la tipizzazione delle neoplasie e per i test genetici.

Questa metodica è stata scoperta nei primi anni 80, si è evoluta con molteplici varianti (Real time, Nested, RT-PCR, etc….) fino ai giorni nostri, assumendo una notevole importanza nella diagnostica specifica delle malattie infettive batteriche, virali e parassitarie, rilevando l‘agente eziologico direttamente dal paziente, senza aspettarne la sieroconversione.

Approfondiamo questa metodica: viene attuata la sintesi in vitro di un segmento di DNA completo a partire da un filamento singolo, che funge da stampo per il completamento del DNA, attraverso l‘utilizzo di DNA polimerasi, con una sequenza „ a catena“.

Vengono ripetuti più cicli amplificanti, dalle 30 fino alle 50 volte, aumentando di volta in volta il materiale genetico di interesse finché la reazione raggiunge un plateau, dovuto al consumo delle polimerasi e dei primers utilizzati.

A questo punto sappiamo se c‘è stata la replicazione del materiale genetico di interesse (esito positivo) oppure se nel materiale preso in esame non abbiamo alcun DNA patologico (esito negativo).

Prendiamo in esame i vari passaggi:

• la sequenza viene estratta da vari materiali e separata in due monofilamenti (denaturata)
• viene preparata una soluzione dove sono poi aggiunti dei nucleotidi liberi
• il tutto in particolari condizioni di temperatura e pH, per un certo periodo di tempo
• si aggiungono dei primers, ovvero delle brevi sequenze di RNA complementari a due acidi nucleici delle estremità 5 e 3 dei due filamenti da riprodurre con le sequenze di interesse, che innescano la reazione
• si aggiunge una DNA polimerasi termoresistente (Taq-polimerasi) ed altre sostanze che agevolano la reazione
• si aspetta e si valuta poi se l‘amplificazione genica del genoma di interesse sia avvenuta

Per ridurre le fonti di errore – si tratta di una serie di reazioni delicate e molto sensibili è necessario che:

• l‘estrazione e la denaturazione del DNA da prendere in esame siano attuati in condizioni controllate, in caso contrario le reazioni non avvengono od avvengono in modo alterato, dando luogo ad errori interpretativi
• il DNA target – cioè il segmento genetico da analizzare – deve essere relativo a parti e/o funzioni vitali o che codifichino la patogenicità del microrganismo che si vuole ricercare, per non rischiare di amplificare parti di genoma aspecifiche comuni e di scarsa utilità diagnostica
• I primers quindi devono essere specifici per le sequenze genomiche patologiche (es. Rhodococcus ), oltre che essere inseriti nella soluzione in concentrazione idonea con precise diluizioni scalari, in quanto diversamente si avrebbero dei falsi negativi
• anche la concentrazione di magnesio e dei nucleotidi da utilizzare per la sintesi e le temperature delle varie reazioni enzimatiche devono rispettare un certo range per una perfetta funzionalità della polimerasi, dei primers, delle sonde che li agganciano e per la conservazione del DNA da esaminare
• l‘interpretazione della reazione passa attraverso l‘analisi delle curve di amplificazione e del plateau che determina la fine del test
• usualmente si lavora sotto cappa a flussi laminari, con pipette dedicate e puntali con filtri per evitare le contaminazioni con materiale genetico estraneo.

Materiale utilizzabile per l‘estrazione

L‘estrazione del genoma di interesse diagnostico è possibile da molti materiali: sangue intero, cute, croste e peli, tampone senza medium proveniente da scoli, tessuti vari preferibilmente non fissati, feci, urina e sperma, liquidi cavitari, etc. scelti anche in base alle caratteristiche della malattia.

Nel cavallo ad esempio:

• sangue in EDTA e zecca per gli emoparassiti
• tampone a secco da scolo oculo-nasale e sangue in EDTA per le malattie respiratorie
• tampone a secco / materiale abortivo o sangue in EDTA per le forme che provocano aborto
• sperma (anche congelato) per le malattie veneree
• sangue in EDTA per forme virali neurologiche
• feci per le malattie del tratto gastroenterico
• urina
• tampone a secco da ascessi per malattie batteriche (Streptococcus E Rhodococcus)
• sangue in EDTA e criniera con bulbo pilifero per i test genetici
• peli, croste e tessuto non fissato per Dermatofiti e Sarcoide equino

Si consiglia di chiedere nello specifico al Laboratorio il dettaglio del materiale idoneo per l‘agente eziologico da ricercare per ciascuna malattia.

Varianti utilizzate presso Laboklin:

• Real time PCR: permette di quantificare in tempo reale oltre che amplificare il DNA ricercato, attraverso l‘utilizzo di marcatori fluorescenti.
• Nested PCR: permette di ridurre l‘amplificazione di siti aspecifici non corretti, attraverso l‘utilizzo di 2 set di primers, uno che amplifica un target secondario della prima reazione, che si attiva quindi solo se la prima reazione ha avuto luogo nel modo Si utilizza per aumentare la specificità della PCR su substrati difficili.
• RT-PCR (Reverse transcriptase PCR): si tratta di una PCR che lavora su stampi ad RNA che vengono trascritti a cDNA tramite una trascrittasi Parte di questo DNA viene poi amplificato come nella classica reazione.
• Melting curve analysis / Agarose gel electrophoresis: permettono di implementare i risultati di una PCR attraverso l‘analisi ulteriore del DNA prodotto dalla reazione di amplificazione, per stabilirne unicità e specificità, indice di accuratezza e correttezza diagnostica (o per differenziare, per esempio, Babesia vs Theileria, o Streptococcus sp.).

Per la diagnostica delle malattie infettive e parassitarie possiamo avvalerci di molteplici metodiche che utilizzano siero, plasma od altri materiali, differenti di volta in volta a seconda delle caratteristiche peculiari della malattia che costituisce il sospetto diagnostico. Un‘importante differenziazione è quella tra la ricerca del titolo anticorpale / antigenico dopo contatto del sistema immunitario con l‘agente infettivo (anticorpo, Ac – antigene, Ag) e la ricerca ed amplificazione genica dell‘agente eziologico dopo prelievo del materiale idoneo tramite PCR (Polimerase chain reaction).

Titolazione anticorpale (Ac)

Si effettua generalmente su siero o plasma. Permette di valutare la presenza di anticorpi (quindi una sieropositività) dopo che il sistema immunitario del paziente, non immunodepresso, ha preso contatto con l‘agente eziologico oggetto di ricerca. Questo comporta la scelta del momento migliore per il prelievo ed uno sforzo supplementare per l‘interpretazione dei risultati: una sieropositività infatti non indica necessariamente malattia, viceversa definisce un contatto diretto attuale o pregresso o ancora può indicare una vaccinazione avvenuta (gli anticorpi vaccinali sono raramente differenziabili). A questo proposito è molto importante chiarire il concetto di siero-conversione, che è un criterio di interpretazione basilare: effettuo un primo prelievo entro il 5° giorno dall‘inizio della sintomatologia e successivamente effettuo un secondo prelievo dopo 15-45 giorni dal primo. Confronto i titoli Ac rilevati: ho una positività se nel secondo esito l’aumento del titolo anticorpale è di almeno 4 diluizioni in base 2 (1:8 / 1:16 / 1: 32…) oppure, col solo siero/plasma prelevato dopo 15-45 giorni, se il titolo supera la soglia convenzionale fissata per quella data malattia che empiricamente indica un contatto con il patogeno / una profilassi vaccinale. Per alcune malattie gravi del cavallo la semplice positività è sufficiente a confermare la diagnosi anche in assenza di sintomatologia, attivando quindi le procedure di Polizia Veterinaria previste, con l’isolamento del soggetto: è il caso dell‘Anemia infettiva equina e della Morva, mentre per l‘Arterite virale ed il Morbo coitale maligno oltre alla positività viene valutata anche la presenza / eliminazione dell‘agente eziologico con lo sperma o tramite le vie genitali prima di escludere il soggetto dall‘attività riproduttiva.

Metodiche di titolazione Ac

ELISA indiretta: si tratta della metodica più recente, standardizzata e veloce, utilizzabile per una titolazione anticorpale. Gli anticorpi del siero/plasma in esame (se presenti) si fissano su una fase solida con l‘antigene (pozzetto), si aggiunge il marcatore con un enzima (perossidasi) e un substrato cromogeno. Se il cromogeno incontra la perossidasi del marcatore che si è fissato alla fase solida in presenza degli anticorpi, abbiamo una reazione colorimetrica del pozzetto, altrimenti in assenza di anticorpi la reazione non avviene ed il campione non mostra alcun colore. Il pozzetto con la diluizione maggiore che mostra viraggio permette di quantificare la presenza degli Ac (maggiore è la diluizione che si colora, maggiore è la quantità di anticorpi presente).

Nella Competitive ELISA invece abbiamo un ulteriore passaggio: la colorazione viene valutata non direttamente ma tramite aggiunta di un secondo marcatore colorato che si fissa sul substrato in assenza di coniugazione con il primo marcatore: in questo caso si avrà colorazione in caso di assenza di anticorpi nel campione in esame ed il risultato espresso in % di colorazione va letto in senso inverso (maggiore è la colorazione, minore è il titolo anticorpale perché minore è la coniugazione con il primo marcatore). I valori ottici della colorazione espressa dalla reazione ELISA non sono correlabili con il titolo bensì con le caratteristiche del cromogeno, quindi l‘interpretazione dei risultati non è operatore-dipendente.

Immunofluorescenza indiretta: la metodica indiretta prevede che gli anticorpi del siero/plasma da testare, se presenti, reagiscano legandosi ad un substrato di antigeni, utilizzando poi un secondo anticorpo coniugato con la sostanza fluorescente che si leghi al primo complesso Ag-Ac, quando presente, determinando vari gradi di fluorescenza, valutabile come intensità da un operatore. Si tratta di una metodica di notevole amplificazione, molto sensibile, ma la fluorescenza deve essere interpretata e possono esserci casi dubbi sui valori soglia.

Agglutinazione passiva diretta: il principio utilizzato è la precipitazione dei globuli rossi (Gr) che si verifica se nel siero/plasma preso in esame vi è la presenza di anticorpi ad effetto agglutinante, utilizzando delle diluizioni seriali di materiale da esaminare e mettendole in contatto con dei Gr coniugati ad una quantità fissa di antigene. Risulta possibile valutare la sieropositività del campione espressa dalla formazione di un reticolo di eritrociti con precipitazione sul fondo del pozzetto e surnatante limpido. Viceversa, se il complesso Ag-Gr rimane in sospensione, senza che sia avvenuta quindi una agglutinazione, consideriamo il campione negativo. Molto sensibile e specifico, necessita di incubazione a temperatura controllata.

Inibizione dell‘emoagglutinazione: viene utilizzata quando gli agenti eziologici sono emoagglutinanti, sia virus che batteri, mentre gli anticorpi ricercati non lo sono. Mettendo in contatto le varie diluizioni di siero/plasma da testare con una quota fissa di antigene ed una quota di globuli rossi, se non si verificano degli immunocomplessi Ag-Ac si avrà emoagglutinazione con precipitazione verso il fondo del pozzetto delle emazie e quindi il campione testato risulterà negativo. Viceversa, una soluzione in cui gli eritrociti rimangono in sospensione indica che nel materiale da testare sono presenti anticorpi che inibiscono la precipitazione e quindi considero il campione positivo con una titolazione corrispondente alla prima diluizione che non presenta agglutinazione.

Fissazione del complemento: permette di evidenziare una categoria di anticorpi che non danno alcuna azione visibile interagendo con l‘antigene ma fissano il complemento che è composto da una serie di proteine presenti nella parte liquida del sangue che interagiscono con le membrane cellulari attivandone la lisi, coadiuvando e completando appunto l‘azione del sistema immunitario. Si mette in contatto il siero/plasma da testare con l‘Ag e si incuba a 56° C per 30 minuti per attivare il complemento. Se si verifica la reazione Ag+Ac, questo „fissa“ il complemento che quindi non è più disponibile per altre reazioni (in questo caso per la lisi delle emazie se si immettono successivamente degli eritrociti con Ac anti emazie abbinati) e possiamo considerare il nostro campione positivo. Se invece il materiale da testare è privo di anticorpi, il complemento rimarrà libero ed avremo l‘emolisi nella seconda reazione che qualifica il nostro campione come negativo.

Sieroneutralizzazione: si utilizza per la diagnostica sierologica da virus citopatogeno, che provoca cioè dei danni visibili su tessuto-coltura. Il virus incubato nella tessuto-coltura, posto a contatto con l‘emosiero di un soggetto con anticorpi, perde il suo potere infettante perché gli Ac specifici ricoprono i virioni ed ne impediscono l‘adsorbimento in condizioni di temperatura e tempistica adatti. Se il virus è rimasto libero, posso vedere sul tessuto un effetto citopatico con interruzione del monostrato cellulare, viceversa ciò non avviene. Il titolo sieroneutralizzante risulta essere la diluizione massima che neutralizza il virus. L‘allestimento delle linee cellulari e delle diluizioni virali standardizzate non risulta molto pratico, quindi quando possibile si preferiscono metodiche più recenti ed immediate come ELISA e IF.

Immunodiffusione in gel di Agar (AGID test): si tratta di una metodica di precipitazione radiale, semi-quantitativa, ad interpretazione, che richiede tempistica di almeno 24 ore. Si utilizza una piastra di Petri con un pozzetto centrale contenente l‘Ag, circondato da 3 pozzetti con reagente con Ac e 3 pozzetti dove posizionare il siero da testare. Se il siero è negativo, avremo delle linee di precipitazione Ag-Ac sul gel di Agar solamente tra il pozzetto centrale con l‘Ag ed i 3 conosciuti positivi (gli altri 3 pozzetti non avranno alcuna linea), altrimenti avremo altre linee di precipitazione, una per ogni campione positivo dei 3 da esaminare. È la metodica ufficiale per la conferma di positività per l‘Anemia infettiva, purtroppo la tempistica è di almeno 24 ore e l‘allestimento delle piastre è piuttosto laborioso ma a differenza della metodica ELISA non sono possibili reazioni crociate.

La dermatologia equina ha avuto un notevole sviluppo negli ultimi anni grazie anche al continuo affinarsi di nuove metodiche di laboratorio che rendono possibile una diagnosi eziologica sempre più accurata, base per l’impostazione di un’idonea terapia.

Vediamo quindi quali sono le varie metodiche di campionamento per la diagnostica dermatologica, utilizzabili ogniqualvolta ci troviamo di fronte  ad una dermatite.

Citologia cutanea

Scotch test: particolarmente indicato per le lesioni superficiali asciutte, si effettua tramite apposizione ripetuta, su tutta la zona affetta, di un nastro adesivo che permette la raccolta di materiale crostoso, scaglie di epitelio, escreti e pus, batteri e miceti superficiali.

La cute deve essere pulita con soluzione fisiologica ed il materiale raccolto può essere depositato con la banda adesiva su vetrino ed inviato per un esame microscopico completo.

In questo modo è possibile rilevare batteri, ife fungine ed ectoparassiti esterni con le loro uova, soprattutto se presenti in aree estese, con poche lesioni patognomoniche.

Apposizione: indicata per le lesioni  essudative, con le medesime modalità dello scotch test ma con l’ausilio di un vetrino portaoggetti.

Dopo asciugatura all’aria il vetrino può essere inviato al  laboratorio dove verrà colorato con le colorazioni più idonee al caso.

Agoaspirato fine per infissione: indicato in caso di lesioni nodulo-papillari, infiggendo un ago ipodermico ed applicando una lieve aspirazione in più direzioni, in questo modo le cellule intrappolate nell’ago vengono successivamente schizzate con l’ausilio della siringa su un vetrino ed inviate, una volta asciugate all’aria o strisciate come un campione ematico se la quantità è molto abbondante.

Aspirati, secrezioni ed escrezioni possono essere inviati anche in una provetta con EDTA. Se non è possibile procedere subito con con il loro striscio, devono essere spediti in giornata, in modo da poter essere esaminati nell’arco delle 24 ore successive al prelievo.

Per l’esame batteriologico di questi prelievi invece si preferiscono provette sterili, vuote, senza anticoagulante.

Prelievo di pelo

Indicato quando abbiamo, oltre al prurito, aree alopeciche e materiale crostoso forforaceo visibile. Questo prelievo va effettuato preferibilmente con delle pinze emostatiche, senza scarificare la cute, prelevando tutto il pelo (anche il bulbo, strappando) ai margini delle zone alopeciche o in corrispondenza di lesioni.

E’ preferibile pulire la zona con alcool, strofinando leggermente senza provocare abrasione, e mettendo poi il materiale raccolto in un contenitore sterile da inviare al laboratorio, che lo seminerà su idonee piastre per la diagnostica micologica e batteriologica.

La coltura è sempre necessaria per la tipizzazione del micete / batterio presente sul campione in quanto alcune ife / corpi batterici visibili all’esame microscopico potrebbero essere saprofiti non patogeni di  origine ambientale, trattandosi di un distretto, quello cutaneo, molto esposto a contaminanti accidentali.

Tricogramma

Prelevando dei peli con la medesima metodica ed applicandoli su un vetrino con una goccia di paraffina, è possibile valutarne la morfologia ed il pattern di crescita per la diagnosi delle patologie riguardanti la crescita follicolare (alopecia areata, telogen, …) e l’eventuale presenza di funghi o parassiti.

Scarificati cutanei superficiali / profondi

Si effettuano applicando nell’area da prendere in esame dell’olio di vaselina ed effettuando degli scarificati con una lama chirurgica sterile, in modo superficiale o più profondamente, prendendo una piega cutanea tra le dita e strofinando energicamente la zona con la lama ad angolo retto finché non si provoca sanguinamento.

Il materiale in questo modo raccolto può essere strisciato su vetrino o introdotto in una provetta sterile per poi essere inviato in laboratorio per la coltura.

Questi scarificati permettono di diagnosticare una parassitosi da Psoroptes spp. / Chorioptes spp. / Dermanyssus e/o la presenza di micosi od infezioni degli strati più profondi della cute.

Tamponi cutanei per coltura (con terreno Amies)

È necessario prestare particolare attenzione ai tamponi per l’esame batteriologico di questo distretto: la cute del cavallo presenta molto spesso una popolazione microbica commensale molto ampia. È quindi preferibile effettuare questo esame in corrispondenza di lesioni evidenti o in alternativa mediante un ago-aspirato in caso di aree di dermatite diffusa o meglio ancora procedendo con prelievi bioptici, immediatamente prima di immergere nella soluzione di formalina il materiale asportato, per un’analisi accurata degli strati più profondi.

Non bisogna pulire con alcool od altri detergenti la parte, cercare di apporre invece il tampone su una lesione significativa od utilizzare un ago sterile per aprire pustole, ascessi o per rimuovere croste.

Il tampone in oggetto, inserito in terreno di coltura (Amies), deve essere spedito in temperatura controllata entro 24 ore dal prelievo, per ridurre al massimo la crescita di batteri opportunisti.

Laboklin dispone di appositi terreni selettivi contro muffe e saprofiti ambientali la cui crescita può rendere le colture cutanee del cavallo di difficile interpretazione quando seminate su terreni standard.

Ogni scarificato cutaneo viene inoltre campionato per un controllo al microscopio ottico, quando possibile.

Molto importante inoltre la tipizzazione dell’agente batterico / micotico rilevato e la corretta interpretazione in senso clinico-patologico delle colonie risultanti, se presenti in primo o secondo isolamento, ed il pattern di crescita di queste ultime.

Se la colonia di batterio / micete cresciuto è considerata patologica (secondo le caratteristiche precedentemente enunciate), il laboratorio appronterà un esteso antibiogramma, se non diversamente indicato dal veterinario, permettendo di iniziare quanto prima una idonea terapia antibiotica (la tempistica è di 2-3 giorni), secondo le moderne linee guida per la riduzione dell’antibioticoresistenza.

Tamponi cutanei a secco / materiale cutaneo per la diagnostica tramite PCR

Presso Laboklin è possibile effettuare un esame PCR per rilevare la presenza di DNA batterico / virale per alcune patologie cutanee. Si richiede l’invio di materiale crostoso, peli, cute in provetta sterile o di prelievi effettuati per mezzo di un tampone asciutto, senza terreno di trasporto. Le patologie che è possibile testare sono:

• BPV 1/2: sarcoide equino
• Dermatofiti
• Streptococcus equi/zooepidemicus
• Taylorella equigenitalis
• Arterite virale

Biopsie cutanee

Le biopsie cutanee si possono ottenere da punch cutaneo o per escissione diretta ma anche da agoaspirato. Tutto il materiale prelevato  deve essere immerso in una soluzione salina con formalina al 4%.

La cute da prelevare va pulita ma non disinfettata. Si consiglia di procedere con una sedazione o con un’anestesia locoregionale per poter effettuare il prelievo di un campione significativo in sicurezza.

Le biopsie sono particolarmente importanti per una diagnostica cito-istologica esaustiva ma anche per effettuare altri esami di approfondimento come:

• immunoistologia
• immunofluorescenza diretta od indiretta
• PCR per la ricerca di agenti eziologici (in questo caso meglio immergere i campioni in soluzione salina)

Per prelevare dei campioni idonei si consiglia di utilizzare delle lame da bisturi (non forbici) per evitare eccessivo schiacciamento / manipolazione del campione e degli  aghi sterili  per introdurre i campioni nella soluzione di Formalina al 4%. La dimensione ideale del campione da sottoporre ad esame bioptico è tra 4 e 5 mm di diametro. Campioni solidi di dimensioni maggiori devono essere tagliati in più parti o la soluzione con formalina deve essere iniettata internamente se non si vuole alterare la morfologia del campione (p.es. occhio). Anche più campioni riguardanti medesimi distretto / patologia vengono conteggiati come biopsia singola in modo da poter giungere più facilmente ad una diagnosi corretta.

Test allergologici per le patologie dermatologiche

È inoltre possibile effettuare dei test allergologici sierologici, qualora si giunga ad una diagnosi di dermatite allergica, per una corretta investigazione sull’allergene responsabile della sindrome cutanea. Si tratta di un metodo pratico ed affidabile a disposizione del clinico in campo da affiancare alle terapia topica cutanea, utile nell’immediato ma scarsamente risolutiva.

Laboklin offre questi esami allergologici (campione richiesto: siero):

– test di screening: vengono testati i principali gruppi di allergeni, quali acari, pollini, spore fungine, Di questo primo test si approfondiscono i vari gruppi che hanno dato positività:

• allergeni stagionali per i pollini
• allergeni annuali per le spore fungine e gli acari
• insetti

Questi approfondimenti sono obbligatori per l’allestimento della soluzione iposensibilizzante/ASIT che permette, quando somministrata regolarmente, di ridurre l’iperreattività del sistema immunitario causa della sintomatologia allergica.

– profilo penne/peli e forfora

– profilo allergeni alimentari (con possibilità di allestimento successivo di una razione ad eliminazione degli alimenti che provocano reazione allergica)